口腔鱗狀細胞癌中IGF1的表達及其臨床意義

曾 潔,祖木熱提古麗·阿不來提,馬琰迪,俞雪燕,夏飛飛,徐 江

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)約占口腔癌的90%,是一個日益嚴重的全球健康問題,到目前為止,盡管對OSCC的手術方法和輔助治療不斷改進,但5年生存率沒有顯著增加[1- 2]。胰島素樣生長因子1 (insulin like growth factor 1,IGF1) 是一種多效性因子,可循環至全身各處,由70多個氨基酸組成[3],其結構類似于人類胰島素原,是多種正常和惡性細胞的生存、生長因子[4]。IGF1的表達與多種腫瘤相關,如結腸癌、乳腺癌和前列腺癌患病風險的增加被認為是由IGF1的增殖作用引起[5]。該實驗將采用免疫組織化學Envision法,測定在OSCC和鄰近正常組織中IGF1的表達情況,分析IGF1表達與OSCC臨床特性和預后之間的關系,并從細胞水平進一步檢測其表達情況。

1 材料與方法

1.1 組織標本和細胞系115份OSCC組織樣本(OSCC組)及74份正常組織樣本(正常組)(距離癌組織2 cm以上)均來自石河子大學第一附屬醫院2004—2019年間確診的OSCC患者,由2位高年資病理醫師對標本進行診斷并制作成組織芯片,收集相對應的基本病理信息及臨床資料,通過電話、醫院病歷或其他方法等,在115例OSCC患者中隨訪70例。本研究經石河子大學第一附屬醫院倫理委員會批準(編號:A2021-073-01)。

本研究中使用了1種人口腔角質細胞株(HOK)和4種OSCC細胞系(CAL-27、TCA8113、SCC-15、SCC-25),其中HOK購自北京北納生物科技有限公司,CAL-27、SCC-15購自美國ATCC細胞庫,SCC-25、TCA8113細胞購自上海吉凱基因科技有限公司。

1.2 主要儀器與試劑細胞培養箱、超凈工作臺、-80 ℃冰箱購于美國賽默飛世爾科技有限公司;電泳儀、濕轉轉膜儀購于美國Bio-rad公司;蛋白成像儀購于上海天能公司;熒光定量PCR儀購于美國Agilent公司。兔抗IGF1單克隆抗體(ab263903)購于英國Abcam公司;GAPDH抗體(K200057M)、青鏈霉素混合液(P1400)購于北京索萊寶科技有限公司;辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)、免疫組化試劑盒(PV-6001)購于北京中杉金橋生物技術有限公司;DMEM、RPMI-1640培養基、血清購于以色列BI公司;反轉錄試劑盒(CW2582)、qRT-PCR試劑盒(CW2623)購于江蘇康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組織化學 選取Envision二步法進行實驗:切取經甲醛固定和石蠟包埋的4 μm組織切片,將組織切片依次在二甲苯、乙醇中脫蠟水化,室溫下用3%H2O2封閉10 min后洗滌,然后將所有切片與IGF1一抗(1 ∶500)在4 ℃孵育過夜,繼而與二抗孵育,PBS沖洗后DAB顯色,蘇木精核染色后封片,顯微鏡下閱片。

結果判定:以呈棕黃色顆粒為陽性,IGF1染色總得分=著色強度得分×陽性細胞百分比;為了便于統計分析,以<7為低表達,≥ 7為高表達[6],見表1。

表1 免疫組化結果評定標準

1.3.2免疫印跡實驗(Western blot) 收集HOK、CAL-27、TCA-8113、SCC-15和SCC-25五種細胞,用RIPA裂解液分離總蛋白,蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳,結束后轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,用稀釋的一抗(IGF1,1 ∶1 000; GAPDH,1 ∶5 000)4 ℃下孵育過夜。隔天用含0.2%吐溫(TBST)的TBS洗滌6次,每次5 min,后將膜與二抗[山羊抗兔IgG(H+L)-HRP,1 ∶15 000]靜孵2 h,再次洗膜,蛋白成像儀檢測蛋白條帶, Image J 進行蛋白半定量,分析IGF1的相對表達水平。

1.3.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 收集HOK、CAL-27、TCA-8113、SCC-15和SCC-25五種細胞,按照TRIzol 試劑說明提取總RNA,檢測RNA濃度,反轉錄合成cDNA,用特異性引物擴增IGF1和GAPDH,引物序列見表2,以 GAPDH 基因 mRNA 表達水平為標準進行比較,采用2-ΔΔCt法計算上述五種細胞中的IGF1 mRNA的相對表達量。

表2 目的基因引物設計

1.4 統計學處理采用GraphPad Prism 9.0軟件

進行統計分析。用χ2檢驗比較OSCC組織中IGF1的表達水平與臨床病理特征的相關性,存在個別數值的理論頻數小于5時,以連續校正值為χ2檢驗結果。使用ROC曲線評估IGF1的表達高低,從而預測OSCC的免疫組化評分診斷價值。采用Kaplan-Meier法分析IGF1表達對OSCC患者的生存影響,并繪制生存曲線,生存資料中不同變量的風險比采用 COX 回歸分析。計量資料采用表示,應用t檢驗對不同細胞系蛋白及mRNA表達數據之間的差異進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IGF1在OSCC及正常組織中的表達IGF1主要定位于細胞膜,少量定位于細胞質,在OSCC組和正常組組織中均能觀察到IGF1,但是IGF1在OSCC組中的高表達率為72.17%,在正常組中是2.70%,差異有統計學意義(P<0.001)。見表3和圖1。IGF1在OSCC及正常組評分等級間的差異有統計學意義(P<0.05)。見表4和圖2。

圖1 IGF1在不同組織中的表達A:IGF1 在正常組中低表達情況;B:IGF1在OSCC組中高表達情況;1:×40;2:×200;3:×400

圖2 IGF1在不同組織中的表達

表3 OSCC組及正常組中IGF1的表達[n(%)]

表4 OSCC組及正常組中IGF1的表達差異[n(%)]

2.2 IGF1在OSCC組織中的表達與臨床病理因素之間的關聯IGF1的表達與分化程度、T分期、浸潤深度有相關性(P<0.05),與年齡、性別、N分期、TNM分期、吸煙、飲酒、HPV感染無相關性(P>0.05),見表5。

表5 IGF1表達與OSCC臨床病理因素之間的關聯[n(%)]

2.3 IGF1表達與OSCC的ROC曲線分析在本實驗中,使用ROC曲線分析IGF1在OSCC及對照組中免疫組化評分的診斷價值,結果表明IGF1在OSCC的表達曲線下AUC值為0.81,95%CI:0.75～0.87,用診斷臨界值確定OSCC的靈敏度和特異性,靈敏度為0.73,特異性為0.82(診斷臨界點為5),見圖3。

圖3 ROC曲線分析IGF1在OSCC及對照組中免疫組化評分

2.4 IGF1表達與患者預后的關系Kaplan-Meier生存曲線對比OSCC中IGF1表達和患者預后的關系,高表達IGF1的OSCC患者生存時間較低表達患者縮短(P=0.03),見圖4。COX單因素分析顯示OSCC中IGF1表達量(HR=0.37,P=0.006)和分化程度(HR=1.87,P=0.04)和T分期(HR=2.04,P=0.03)和浸潤深度(HR=1.94,P=0.04)是影響OSCC患者生存的重要因素,COX多因素生存分析表明IGF1高表達(HR=0.39,P=0.01)與死亡有關,是影響OSCC患者預后的獨立因素,見表6。

圖4 IGF1表達與OSCC患者預后的生存分析

表6 COX單因素及多因素分析

2.5 IGF1在口腔鱗癌細胞系中高表達為了進一步確定IGF1的表達,使用Western blot檢測了一組人類OSCC細胞系中的IGF1水平,其結果顯示,OSCC細胞系與正?？谇簧掀ぜ毎鸋OK對比,IGF1蛋白的表達水平明顯升高(P<0.01),見圖5。實時熒光定量PCR實驗結果顯示IGF1在OSCC細胞系與HOK相比,mRNA表達水平增高(P<0.05),見圖6。

圖5 IGF1在OSCC細胞系及口腔正常上皮細胞中的蛋白表達1:HOK;2:CAL-27;3:Tca-8113;4:SCC-15;5:SCC-25;與HOK比較:**P<0.01,***P<0.001

圖6 IGF1在OSCC細胞系及口腔正常上皮細胞中的mRNA表達1:HOK;2:CAL-27;3:Tca-8113;4:SCC-15;5:SCC-25;與HOK比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

OSCC常起源于口腔上皮細胞逐漸發展為腫瘤,對患者的面容、功能和生存質量有嚴重影響[7],了解和發現新的臨床生物標志物,對改善患者的預后分層及優化抗癌治療有重要的研究價值。

IGF1在許多細胞類型的有絲分裂途徑中起關鍵作用[8],被認為是一種細胞周期進展因子,參與大多數器官和組織的正常生長、發育和分化以及多種病理情況[9],除此之外,在腫瘤微環境中,IGF1能夠驅動遷移、侵襲和增殖,促進血管生成并維持癌癥干性[10]。腫瘤中 IGF1信號通路的改變已被廣泛研究,循環IGF1水平確實與腫瘤進展無關,但腫瘤產生的局部IGF1和胰島素生長因子受體(IGF1R)表達對疾病預后產生不利影響[11]。本研究免疫組化定性檢查結果顯示,IGF1主要表達在細胞膜,與正常組相比,OSCC組中IGF1過表達(P<0.001),但癌組織并不完全等同于細胞系,單一細胞通過反復傳代等也可能會發生轉化;Western blot半定量實驗顯示IGF1在OSCC細胞系中也高表達,提示IGF1可能參與并促進OSCC的發生、發展進程;qRT-PCR實驗顯示IGF1的mRNA在腫瘤細胞中同樣高表達,提示IGF1很有可能作為癌基因在OSCC中發揮作用。另外,IGF1高表達還與一些臨床特征密切相關,Aslan et al[12]發現IGF1在結腸癌中高表達,并與腫瘤位置和性別相關,Li et al[13]發現IGF1在卵巢癌中的表達與臨床分期呈正相關,且IGF1的表達越高,卵巢癌患者的生存率越低。本研究顯示IGF1的表達水平與T分期、浸潤深度有關(P<0.05),提示IGF1高表達與 OSCC患者較高的腫瘤侵襲性有關。此外,IGF1的表達和分化程度相關(P<0.05),隨著腫瘤組織的分化程度降低,OSCC組織中IGF1的表達水平在增加,提示表達水平與OSCC患者病情程度有關,因此推測IGF1可能參與了OSCC的癌變過程。采用受試者工作特征ROC曲線分析,將OSCC病例與相鄰正常組織進行區分,IGF1的曲線下面積AUC值為0.81,并確定最佳臨界點,特異性是82%,敏感性為73%,可以認為IGF1對OSCC患者具有良好的診斷效力。進一步數據分析IGF1蛋白對OSCC患者預后的臨床價值,應用Kaplan-Meier 生存曲線對患者進行生存分析,高表達的IGF1與OSCC患者較差的整體生存率相關(P=0.03),提示預后不佳;相似的,在軟骨肉瘤中IGF1的表達與預后不良有關[14]。同時對影響患者預后的因素進行COX回歸分析,單因素分析顯示,IGF1表達量、分化程度、T分期和浸潤深淺均是影響OSCC患者預后的危險因素;多因素分析顯示,IGF1表達量是影響患者預后的獨立因素,且IGF1表達越高,患者預后越差。以上研究表明,IGF1高表達與患者的生存率呈負相關,可以作為判斷OSCC預后的指標。