GRB2 rs8082005、RXRA rs3849222位點與延邊地區EOPE易感性的關系

蔡宛軒,劉 霞,金 光,董春玉,楊恩月

子癇前期(preeclampsia,PE)影響全球2%～8%的孕婦,是孕婦圍產期死亡的主要危險因素之一,對母嬰健康有著極大威脅[1-3]。PE以34周作為基本界限,分為早發型子癇前期(early-onset preeclampsia,EOPE)和遲發型子癇前期(late-onset preeclampsia, LOPE)。明確EOPE的發病機制對開展疾病的早期預防和干預至關重要。遺傳因素在EOPE的發病中影響重大。尋找并確定PE的遺傳易感基因,對了解疾病發病機制以及更好地開展疾病的預防與干預工作至關重要[4]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)一方面是遺傳標志物,另一方面還會顯著影響到易感性及預后。

生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,GRB2), 通過調控受體酪氨酸激酶(receptor yrosine kinase,RTK)信號通路來調節眾多細胞的功能[3]。相關報道指出,RXRA實際位于ADIPO通路,人RXRA的實際位置則是染色體9q34.3,其為RXR的重要成員[5-7]。

1 材料與方法

1.1 病例資料本實驗選擇延邊地區居住10年以上,且2015年3月開始在延邊大學附屬醫院和延邊婦幼保健院住院部診斷為EOPE、無其他疾病的382例患者中隨機選取192例作為實驗組;此外,隨機選取同期在延邊大學附屬醫院和延邊婦幼保健院自然分娩的192例健康人群作為對照組。所有受試者均簽署知情同意書。本研究已通過倫理審查。審批文書號:YB.No20180823。

1.2 SNP的選擇通過Regulome-DB數據庫、NCBI-SNP數據庫(MAF>10、LD值:r2<0.8)、Hapmap-SNP數據庫篩選與EOPE相關的28個基因和134個Regulome-SNP位點。經統計分析,28個基因和134個Regulome-SNP位點中GRB2rs8082005、RXRArs3849222位點差異有統計學意義(P<0.05)。

1.3 血樣收集及DNA提取、測序收集患者和健康人清晨的空腹外周血液至枸緣酸鈉抗凝劑試管,并在-20 ℃低溫冰柜(青島海爾集團)儲存備用。提取DNA時按照全血DNA提取試劑盒(日本KURABO公司)說明書通過全血核酸提取儀Quick Gene-810(日本KURABO公司),采用分光光度計Nano Drop-2000(美國伯騰儀器有限公司)測定DNA樣本的濃度及污染度。合格標準:濃度>20 ng/μl,A260/A280:1.65～1.85。將合格的DNA樣本送到北京華大基因公司進行以MassARRAY SNPS質譜為基礎的基因分型。

1.4 PCR-RFLP與基因分型運用相應的引物設計軟件,以及對應的Primer Premier 5.0,進而完成相關引物。設計引物原則為:將聚合酶鏈式反應擴增范圍控制在150～300 bp并且不能含有自身互補序列避免產生引物二聚體;發卡結構以及G+C含量應在40%～60%之間(表1)。依靠查詢軟件來尋求適宜的限制性內切酶,來實現酶切斷的效果(表2)。采用Sequenom MassARRAY?質譜的基因分型法及PCR-RFLP,開展相應的基因分型操作。

表1 位點PCR擴增引物序列及條件

表2 限制性內切酶設計

1.5 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行統計分析,數據資料采用χ2檢驗分析,驗證資料是否匹配采用相應的H-W平衡律,P>0.05說明群體代表性和可比性;運用t檢驗方法,對比病例組、對照組的年齡(P>0.05)差異;運用Logistic回歸分析對比病例、對照組的基因型方面的區別,運用TYPER 4.0軟件分析樣本波峰圖。

2 結果

2.1 rs3849222、rs8082005 SNP分型峰值圖檢測樣本為RXRArs3849222 CC型,則只有C堿基對應分子量位置有峰,而T堿基對應分子量處無峰。見圖1。檢測樣本為RXRArs3849222 TC型,則T堿基對應分子量位置有峰,C堿基對應分子量位置也有峰。見圖2。測樣本為RXRArs3849222 TT型,則只有T堿基對應分子量位置有峰,而C堿基對應分子量處無峰。見圖3。檢測樣本為GRB2rs8082005 CC型,則只有C堿基對應分子量位置有峰,而T堿基對應分子量處無峰。見圖4。檢測樣本為GRB2rs8082005 TC型,則T堿基對應分子量位置有峰,C堿基對應分子量位置也有峰。見圖5。測樣本為GRB2rs8082005 TT型,則只有T堿基對應分子量位置有峰,而C堿基對應分子量處無峰。見圖6。

圖1 RXRA rs3849222 CC基因型

圖2 RXRA rs3849222 TC基因型峰值圖

圖3 RXRA rs3849222 TT基因型峰值圖

圖4 GRB2 rs8082005 CC基因型峰值圖

圖5 GRB2 rs8082005 TC基因型峰值圖

圖6 GRB2 rs8082005 TT基因型峰值圖

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗本研究納入患者及正常對照組各192例,經擬合優度χ2檢驗分析表明納入研究對象的基因型分布頻率均符合哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗(χ2=0.613,P=0.456),提示所研究位點符合在人群中的分布規律,說明實驗組和對照組所選的研究對象來自同一孟德爾群體,具有群體代表性和可比性。

2.3 兩組基本資料的比較本實驗中共選擇實驗組女性192例(100%),對照組女性192例(100%)。經t檢驗分析,兩組在年齡分布比例差異沒有統計學意義。

2.4 多態性與易感性的關系實驗組中GRB2rs8082005 TT、TC、CC基因型分別占比43.8%(84/192)、50.0%(96/192)、6.2%(12/192),對照組中GRB2rs8082005 TT、TC、CC基因型分別占比37.0%(71/192)、46.4%(89/192)、16.6%(32/192)。經非條件Logistic回歸分析,與攜帶TT、TC基因型患者相比,攜帶CC基因型患者更易罹患EOPE(OR=3.155,95%CI=1.513～6.579,P=0.002);在隱性模型中,相比于TT+TC基因型攜帶者,攜帶CC基因型患者EOPE發病風險增加(OR=3.000,95%CI=1.495～6.022,P=0.002)。實驗組中RXRArs3849222TT、CT、CC基因型分別占比9.9%(19/192)、54.7%(105/192)、35.4(68/192),對照組中rs3849222 TT、CT、CC基因型分別占比21.9%(42/192)、39.6%(76/192)、38.5(74/192)。經非條件Logistic回歸分析,與攜帶CC基因型患者相比,攜帶TT基因型患者更易罹患EOPE(OR=2.031,95%CI=1.077～3.820,P=0.028);在隱形模型中,相比于攜帶CC+TC基因型患者,攜帶TT基因型患者增加EOPE發病風險(OR=2.549,95%CI=1.421～4.573,P=0.002)。綜上所述,通過Logistic回歸分析證實了SNPs攜帶(GRB2rs8082005 CC或RXRArs3849222 TT)更容易罹患EOPE,見表3。

表3 GRB2 rs8082005、RXRA rs3849222基因型頻率分布

2.5 基因多態性對攜帶不同基因型患者發生EOPE的影響在聯合基因型分析中,GRB2rs8082005 CC、RXRArs3849222 TT基因型為危險基因型,所以每個個體的危險基因型數在0到2之間(0、1、2),最終得出,與危險基因數0個相比,攜帶危險基因數1個和攜帶危險基因數2個差異具備統計價值(P<0.001)。危險基因型數量與EOPE的發病率呈正相關,攜帶1個或2個危險基因型的患者較不攜帶危險基因型患者更容易患病EOPE。(調整OR=2.779,95%CI=1.665～4.639,P<0.001;調整OR=5.175,95%CI=1.080～24.794,P=0.04)。見表4。

表4 危險基因型個數與EOPE易感性的統計分析

3 討論

早發型子癇前期是所有子癇前期病例中最嚴重的臨床類型,占所有子癇前期病例的 5%～20%,并且與新生兒的發病率和病死率有關[8],它的病情進展快,存在不可預測性,危害高于LOPE[9-10]。如McGinnis et al[11]報告,全基因組關聯研究(genome-wide association studies,GWAS),鑒定SNP與子癇前期有顯著相關性深入分析其發病原理,尋找高效的預防方法,設計對應的治療措施,必然會成為病癥的研究熱點。EOPE發生可能與多個基因參與有關,而遺傳因素在該疾病的發生過程中扮演著重要角色。

GRB2作為銜接蛋白,與體內多種酪氨酸激酶依賴性信號通路有關,因為獨特的自身結構,在多種腫瘤細胞中均有表達,又與胃癌、結腸癌、肝癌的遷移侵襲力相關[12]。王亞楠[13]發現,GRB2基因rs9907177(C>T)位點的單核苷酸多態性與妊娠期高血壓疾病存在易感性,攜帶GRB2rs9907177(C>T)CT和TT組合的基因型人群患HDP的風險高于攜帶CC基因型人群。本論文也研究分析GRB2,結果表明GRB2rs8082005攜帶C等位基因較TT+TC基因型患者增加患EOPE風險。本課題組曾研究過GRB2的SNP,結果可能由于鉑類藥物作用于GRB2rs1044228位點,影響GRB2復合物介導相關的EGFR等信號通路,導致攜帶GRB2rs1044228CC基因型非小細胞肺癌患者生存期更長。

ADIPOQ屬于內皮保護因子,能夠增加胰島素敏感性、減少心血管疾病、抑制巨噬細胞的活性及炎癥因子TNF-α的表達,具有良好的抗炎作用,能有效地抑制內皮細胞產生生物活性因子[14]。血管內皮損傷是EOPE發病的主要環節,TNF-α可促進其他因子損傷內皮細胞,從而降低內皮細胞NO的分泌及增加內皮素的釋放,使許多臟器功能嚴重受損,導致EOPE的發病[15]。EOPE孕婦血清ADIPOQ水平明顯降低,且其病情越重,ADIPOQ水平降低越明顯,可能與ADIPOQ水平下降所致抗炎、抗氧化能力不足、滋養層細胞浸潤障礙加劇、血管內皮功能下降、NO合成不足等機制有關[16]。由于RXRA位于ADIPO通路,會受到影響。因此該研究分析了RXRArs3849222位點與延邊地區孕婦EOPE易感性關系,結果表明RXRArs3849222位點SNP與延邊地區孕婦患EOPE風險存在明顯相關性,且攜帶T和CC+TC等位基因相比攜帶C等位基因型患者增加患EOPE風險。

綜上所述,GRB2rs8082005(C>T)、RXRArs3849222(T>C)可能是EOPE的易感因素,影響妊娠期高血壓的發生。由于EOPE是由遺傳因素導致的妊娠期疾病,受多個基因、位點的調控,且環境、飲食、生活方式等也會對其發生發展產生影響[17]。該研究有一些局限性,如研究樣本選擇來自吉林省延邊朝鮮族自治州,這可能造成了選擇偏倚并影響了結果。后續研究中,可聯合多地區、多民族收集樣本進一步研究RXRA、GRB2基因多態性與疾病的關系,明確是否存在地域影響。