miR-361-3P調控轉化生長因子β1誘導成骨細胞凋亡的研究

王帆，王鵬皓

（中國醫科大學附屬第一醫院骨科，沈陽 110001）

人體骨骼的正常代謝依靠成骨細胞與破骨細胞的動態平衡維持。這種動態平衡受骨組織周圍微環境中存在的多種細胞因子調節，其中，轉化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 作為骨組織局部微環境中至關重要的調節因子，在成骨活動中發揮十分重要的作用［1］。細胞凋亡使細胞在基因控制下程序性死亡，進而維持體內細胞數量動態平衡，影響組織周圍內環境相對穩定。研究［2］證明，微RNA （micro RNA，miRNA） 對成骨細胞的再生、轉化、分化等代謝過程起至關重要的作用。目前對miR-361-3P在骨代謝相關疾病中的研究較少見，且其對成骨細胞自我程序性死亡的作用機制尚未清楚。因此，本研究擬通過分子生物學技術檢測人成骨細胞內miR-361-3P對TGF-β1和細胞凋亡標志分子caspase 3蛋白活性表達的影響，以探討miR-361-3P/TGF-β1通路在人成骨細胞凋亡中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

用DMEM培養液 （含10 % 胎牛血清、300 mg/L G418） 于37 ℃、5% CO2培養箱中培養人成骨細胞系hFob1.19 （北京307-青藤轉化醫學中心）。

1.2 細胞分組及轉染

miR-361-3p mimic （mimic）、miR-361-3p inhibitor（inhibitor） 和 TGF-β1 siRNA （si-TGF-β1） 均購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。將hFob1.19細胞隨機分為control組、mimic組及其陰性對照組 （mimic-NC組）、inhibitor 組及其陰性對照組 （inhibitor-NC組）、si-TGF-β1及其陰性對照組 （si-NC組）。采用Lipofectamine 2000脂質體轉染系統 （北京中杉金橋生物有限公司），于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下行細胞轉染8 h。

1.3 CCK-8實驗

將hFob1.19細胞轉移至6孔板，培養48 h，每孔加入10 μL CCK-8 （5 mg/mL，北京中杉金橋生物有限公司），孵育2 h，450 nm 處檢測吸光度。

1.4 實時PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol試劑提取細胞總RNA。采用Nanodrop 2000測定RNA樣品的濃度和純度。用primematipt混合RT 隨機引物對mRNA行逆轉錄。用TRIzol reagent行miRNA逆轉錄。……