XIRP2和HCN4在心肌脂肪浸潤致猝死者心臟傳導系統表達研究

張 靜,陳 巍,丁 艷,劉展展,曹 暢,方世勇,朱旭陽,陳 光,徐 祥

(1.皖南醫學院 法醫學院,安徽 蕪湖 241002;2.蕪湖市公安局 刑警支隊,安徽 蕪湖 241000;3.阜陽市公安局 刑事科學技術研究所,安徽 阜陽 236000)

心肌脂肪浸潤(myocardial adipose infiltration)既往稱為脂肪心(adipositas cordis),以心肌間質出現脂肪浸潤為特點,病變常見于右心室,嚴重者可引起心源性猝死,且死者生前無明顯癥狀或體征,診斷主要依靠尸體解剖和組織病理學檢查[1-2]。既往研究發現心肌脂肪浸潤可累及心臟傳導系統,出現竇性心動過緩及房室傳導阻滯[3],提示猝死機制可能與心律失常相關。目前心肌脂肪浸潤致猝死案例中心臟傳導系統相關分子標記物的研究尚未見系統報道。含心肌動蛋白重復序列蛋白2(xin actin binding repeat containing protein 2,XIRP2)為含心肌動蛋白重復序列蛋白(xin actin binding repeat containing protein,XIRP)家族成員,XIRP2能夠調控XIRP1[4],影響離子通道定位過程,進而影響心肌電生理功能[5]。超極化激活環核苷酸門控陽離子通道4(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)屬于超級化激活環核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因家族,包含HCN1～HCN4四個亞型,其中HCN4主要表達于心臟傳導系統竇房結組織中,對竇房結正常起搏功能和竇性停搏時浦肯野細胞自動節律的產生有重要意義[6]。本研究主要觀察心肌脂肪浸潤猝死者心臟傳導系統XIRP2和HCN4蛋白表達情況,探討XIRP2和HCN4作為分子標志物的可行性,以期為該類案件的法醫學鑒定提供參考。

1 資料與方法

1.1 分組 收集某司法鑒定中心2015～2022年明確診斷心肌脂肪浸潤致猝死者8例為猝死組,選取10例外傷致死者為對照組。每例均經大體解剖、組織病理學檢驗及常規毒(藥)物檢驗。針對尸體標本可能進行的科學研究實驗已在尸檢告知書中通知死者家屬并獲得同意。本研究符合醫學倫理要求。

1.2 試劑 兔抗人HCN4抗體(APC-052,Alomone公司,以色列),兔抗人XIRP2抗體(11896-1-AP,Proteintech,美國);DAB顯色液(北京天根生化科技有限公司);HE和Masson三色染色試劑盒(北京雷根生物有限公司)。

1.3 方法 收集死者性別、年齡、既往史、大體解剖所見及組織病理學檢驗信息,其中組織病理學檢驗包括心臟傳導組織HE染色和Masson三色染色,免疫組織化學染色(IHC)觀察HCN4和XIRP2蛋白表達情況。

1.3.1 HE染色 心臟取材,固定后脫水、透明、浸蠟、包埋,制備5 μm厚的石蠟切片,70℃烘烤1 h脫蠟。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min,梯度酒精脫蠟至水。蘇木精10 min,水洗5 min,1%鹽酸乙醇分化5 s,自來水藍化5 min,伊紅染色30 s,脫水,透明,中性樹膠封固。

1.3.2 Masson三色染色 切片脫蠟步驟同上。Weigert鐵蘇木素10 min,酸性乙醇分化液5 s,Masson藍化液30 s,蒸餾水洗1 min,麗春紅品紅7 min,弱酸工作液1 min,磷鉬酸分化,弱酸工作液、苯胺藍、弱酸工作液各1 min,無水乙醇快速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.3.3 IHC 切片脫蠟步驟同上。3%H2O2室溫避光封閉30 min,0.01 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復液高溫加熱15 min,5%BSA封閉液室溫封閉1 h。一抗4℃過夜孵育,次日,37℃復溫30 min,PBS溶液漂洗,二抗室溫孵育1 h,PBS溶液漂洗,SABC室溫孵育1 h,DAB顯色,蘇木素復染2 min。

1.3.4 圖像分析 利用Olympus光學顯微鏡觀察免疫組化切片,在統一的背景條件下,從每張切片隨機選取5個視野(200×)進行圖像采集,使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計算各組累積光密度值(integrated optical density,IOD),取均值。

2 結果

2.1 兩組基本情況比較 猝死組8例,男性5例,女性3例,年齡16～82歲,中位年齡48.5歲(26.5,60.5);對照組10例,男性5例,女性5例,年齡24～80歲,中位年齡45歲(31,56)。兩組年齡、性別差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 8例心肌脂肪浸潤致猝死者基本情況

2.2 組織病理學改變 猝死者大體解剖見心外膜脂肪含量多、覆蓋范圍廣,主要侵及右室壁及心臟傳導系統(圖1)。HE及Masson三色染色見右室壁、竇房結、房室結大量脂肪組織浸潤,殘留心肌呈條索狀或孤島狀,心肌細胞萎縮與肥大并存,脂肪細胞間灶性淋巴細胞浸潤,心內膜下心肌及左右束支浦肯野細胞收縮帶壞死(圖2),右室壁脂肪浸潤處,未見膠原纖維組織(圖3)。

A.心外膜大量脂肪覆蓋;B.右室壁脂肪浸潤;C.竇房結脂肪浸潤;D.房室結脂肪浸潤。圖1 猝死組心臟大體解剖

A.竇房結區脂肪浸潤,結細胞明顯減少(100×);B.房室結區脂肪浸潤,結細胞明顯減少(100×);C.浦肯野細胞收縮帶壞死(200×);D.右室壁脂肪浸潤,脂肪間及殘存心肌旁淋巴細胞浸潤(40×)。圖2 猝死組傳導系統及右室心肌HE染色

A.竇房結區脂肪浸潤(100×);B.房室結區脂肪浸潤(100×);C.右室壁脂肪浸潤(200×)。圖3 猝死組傳導系統及右室心肌Masson三色染色

2.3 IHC HCN4與XIRP2蛋白呈棕黃色顆粒,主要表達于傳導系統P細胞及浦肯野細胞的細胞膜和胞漿中(圖4～6);與對照組相比,猝死組HCN4與XIRP2在竇房結房室結內表達增多,左右束支內表達減少。

A.XIRP2在猝死組竇房結呈強陽性;B.XIRP2在對照組竇房結呈陽性;C.HCN4在猝死組竇房結呈強陽性;D.HCN4在對照組竇房結呈陽性。圖4 XIRP2與HCN4蛋白在兩組竇房結表達比較(IHC 200×)

A.XIRP2在猝死組房室結呈強陽性;B.XIRP2在對照組房室結呈陽性;C.HCN4在猝死組房室結呈強陽性;D.HCN4在對照組房室結呈陽性。圖5 XIRP2與HCN4蛋白在兩組房室結表達比較(IHC 200×)

A.XIRP2在猝死組左右束支呈陽性;B.XIRP2在對照組左右束支呈強陽性;C.HCN4在猝死組左右束支呈弱陽性;D.HCN4在對照組左右束支呈陽性。圖6 XIRP2與HCN4蛋白在兩組左右束支表達比較(IHC 200×)

與對照組比較,猝死組竇房結、房室結HCN4、XIRP2蛋白表達水平增高(P<0.05),左右束支HCN4、XIRP2蛋白表達水平降低(P<0.05)。猝死組竇房結及房室結HCN4、XIRP2蛋白表達水平高于左右束支(P<0.05),對照組竇房結及房室結HCN4、XIRP2蛋白表達水平低于左右束支(P<0.05)。猝死組竇房結HCN4蛋白表達水平高于房室結(P<0.05),竇房結XIRP2蛋白表達水平低于房室結(P<0.05)。對照組中XIRP2、HCN4蛋白在竇房結和房室結間表達差異無統計學意義。見表2。

表2 HCN4、XIRP2在兩組傳導系統不同部位表達分析

3 討論

本研究中,心肌脂肪浸潤致猝死者心臟肥大,質量增加,心肌脂肪浸潤以右室及傳導系統為主,符合心肌脂肪浸潤的診斷,HCN4與XIRP2蛋白主要表達于P細胞和浦肯野細胞胞膜與胞漿,與對照組相比,猝死組兩種蛋白在竇房結和房室結內表達升高,與心源性猝死及電擊致死研究結論一致[7-8],而上述蛋白在左右束支表達降低。此外,這兩種蛋白在同組內傳導系統不同部位的表達水平存在差異:對照組上述蛋白在左右束支的表達水平高于竇房結和房室結,猝死組與之相反;猝死組竇房結HCN4蛋白表達高于房室結,竇房結XIRP2蛋白表達水平低于房室結。

既往研究表明,心外膜下脂肪組織能夠調節腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統[9-10],通過刺激細胞增強因子2A激活XIRP2基因表達[10],且XIRP2在竇房結與HCN4共表達[4,11]。HCN4為If通道的結構蛋白[6],心外膜下脂肪細胞通過分泌去甲腎上腺素激活β-腎上腺素能受體可增強If[12-13],過表達HCN4小鼠心臟對心輸出量增高的適應性降低,離子通道功能改變,可增加室速和心力衰竭的風險[14-15],而心力衰竭可引起XIRP2表達增加[11],HCN4過表達小鼠無心肌纖維化,與本研究中竇房結組織病理學表現一致。浸潤的脂肪與心肌細胞間無組織分隔[16],影響上述蛋白表達,HCN4與XIRP2蛋白表達可相互促進。值得注意的是,與對照組相比,猝死組竇房結及房室結XIRP2與HCN4蛋白表達升高,左右束支剛好相反,而猝死組內竇房結和房室結中HCN4與XIRP2蛋白表達存在差異,可能與傳導系統不同部位間的調控差異有關。

目前,關于心肌脂肪浸潤及其導致猝死的原因和機制尚不明確,給法醫學死亡原因鑒定帶來挑戰。上述蛋白在傳導系統不同部位的表達趨勢差異可能為該類案件提供新思路,進一步探討心肌脂肪浸潤引起心源性猝死的分子病理學機制有助于精準法醫學的發展。采用分子影像技術監測其在體狀態下的改變,可在心臟結構改變之前發現心臟電生理功能的異常情況,減緩或逆轉蛋白表達趨勢向病理狀態的改變,可為相關心力衰竭提供新的治療思路[17-18],順應精準醫學的發展趨勢。