肉堿-酰基肉堿轉位酶對膠質母細胞瘤細胞增殖和遷移的影響

王臣慈,肖 敏,潘 楊,盛莉莉

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 腫瘤內科,安徽 蕪湖 241001)

膠質母細胞瘤(Glioblastoma,GBM)是最常見的腦部惡性腫瘤,約占所有腦膠質瘤的54%[1]。GBM目前仍然是不可治愈的疾病,其中位生存期約為15個月,5年生存率不足5%[2]。傳統的治療方式如外科手術、放射治療和化學藥物治療等,仍不能令人滿意[3]。因此,深入研究GBM的分子機制,對于GBM的診斷、治療及預防具有十分重要的意義。

代謝領域的研究為腫瘤的治療打開了一扇新大門,最新研究發現脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)的異常活動與腫瘤發生的各個方面有著諸多關聯,如腫瘤細胞的增殖、轉移及其耐藥性的產生都依賴于FAO的作用,因此FAO的關鍵酶或調節劑已經成為腫瘤研究的熱點[4-5]。FAO主要發生在線粒體中,涉及一系列導致脂肪酸縮短的循環反應,其循環反應主要受3個關鍵酶的調節,分別是肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(carnitine palmitoyltransferase Ⅰ,CPTⅠ)、肉堿-酰基肉堿轉位酶(carnitine-acylcarnitine translocase,CACT)和肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅱ(carnitine palmitoyltransferase Ⅱ,CPTⅡ)。已有文獻報道CPTⅠ的高表達與多種腫瘤的進展相關,如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。同時抑制CPTⅠ也會導致急性髓性白血病中的腫瘤細胞增殖受損[6];也有研究表明CPTⅠ受到抑制后會降低FAO的效率,進而抑制c-myc介導的淋巴瘤的發展[7]。近期有研究表明CACT在人肝癌組織中表達水平較低,可能與肝癌患者預后差密切相關[8]。然而CACT在GBM進展中的生物學功能尚不清楚,因此本研究將著重探討CACT對GBM細胞增殖和遷移能力的影響及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和轉染 鼠源GBM細胞系GL261和CT2A從美國弗吉尼亞州馬納薩斯購買獲得。細胞在含有10%胎牛血清(Gibco,USA)和青霉素-鏈霉素(Solarbio,中國)的高糖培養基(Gibco,USA)中于37℃,5%CO2的培養箱中培養。根據lipofectamine 3000轉染試劑盒(LIFE,USA)說明,大約在細胞60%的密度用siRNA轉染細胞。si-CACT的引物為si-CACT-1:CAAAGGGUUCAAUGCAGUCAUTT;si-CACT-2:CUCACACUCAUGCGAGAUGUUTT;si-CACT-3:GACUCUUAUGAGAGAGGGCAUTT。

1.2 組織標本 收集南方醫科大學深圳醫院15組新鮮GBM組織及癌旁正常腦組織,立即用液氮冷凍至RNA提取。所有患者均簽署知情同意書,男10例,女5例,平均年齡(54.733±10.491)歲。所有組織標本均儲存于南方醫科大學深圳醫院中心實驗室-80℃冰箱及液氮中。本研究經南方醫科大學深圳醫院倫理委員會批準。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 用TRIzol(Ambion,USA)從細胞和組織中提取總RNA(1 μg),使用cDNA合成試劑盒(Thermol-scientific,USA)反轉錄成cDNA,上機設定程序為94℃ 30 s、(94℃ 5 s,50～60℃ 15 s,72℃ 10 s)×40循環,用RT-qPCR檢測CACT的表達水平。CACT的引物,人源正向:GACACGGTCAAGGTCCGAC;反向:GCAGCCATTCC-

CCGATATAGC,鼠源正向:GACGAGCCGAAACCCATCAG;反向:AGTCGGACCTTGACCGTGT,用2-ΔΔCt法檢測CACT表達水平的差異。

1.4 Western blot 本研究中使用的CDK2、MMP-2、MMP-9兔單克隆抗體均購自Abclonal公司,GAPDH兔單克隆抗體均購自CST公司。使用含有RIPA裂解緩沖液來裂解細胞以獲得細胞蛋白質,并通過BCA蛋白質檢測試劑盒(Thermo,USA)進行蛋白濃度測定。將30 μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE膠電泳分離,并轉移到PVDF膜上,室溫下用含有10%脫脂牛奶的TBST緩沖液(Bio-Rad,USA)將膜封閉1.5 h,然后在4℃用稀釋的一級抗體孵育過夜,次日室溫下用HRP結合的次級抗體孵育1 h。ECL顯色液顯色(Bio-Rad,USA)并觀察印跡。

1.5 CCK-8實驗 使用CCK-8試劑盒(biosharp,China)檢測GBM細胞株的細胞活性。細胞以1 000個/孔的密度接種于96孔板中,在轉染24、48、72 h后,將CCK-8試劑分別在每孔中加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h,使用多檢測微板閱讀器(Bio-Tek,USA)檢測450 nm波長下的吸光度值(OD),重復3次。

1.6 細胞劃痕實驗 將轉染細胞消化并鋪在6孔板,待細胞融合率達90%左右時,用20 μL的槍頭垂直劃豎線,然后用PBS輕輕沖洗3次,洗去脫落的細胞,繼續加入新的培養基進行培養,分別在0、24 h進行拍照。

1.7 平板克隆實驗 在6孔板中每孔加入1 000個細胞培養14 d,期間定期更換新的培養基。14 d后顯微鏡下觀察細胞成團生長且細胞狀態良好后,棄去培養基,PBS輕輕沖洗1次,4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min,再次用PBS沖洗1次,1%結晶紫染色20 min,結果用Image J軟件進行分析。

1.8 EdU法檢測細胞增殖 細胞經相應處理后加入EdU試劑A孵育2.5 h,然后經過細胞固定、Apollo染色、DNA染色,倒置熒光顯微鏡檢測并計算EdU陽性信號細胞百分比。

2 結果

2.1 CACT在GBM組織中高表達 課題組通過GEPIA在線數據庫分析發現,CACT在人GBM組織中的表達較正常腦組織上調(P<0.05,圖1A)。為了驗證數據庫中結果的可靠性,本課題組收集了南方醫科大學深圳醫院神經外科GBM患者的癌組織及癌旁正常腦組織并提取組織中的總RNA,研究發現CACT在GBM組織中的表達水平較癌旁正常腦組織高,差異有統計學意義(t=2.310,P=0.036,圖1B)。

A.GEPIA在線數據庫分析CACT在GBM表達水平;B.RT-qPCR驗證GBM組織和癌旁組織中CACT表達水平;*P<0.05。圖1 CACT在GBM組織中高表達

2.2 敲低CACT可以抑制GL261和CT2A細胞的增殖和遷移 為了研究CACT對GBM細胞的增殖和遷移能力的影響,將CACT siRNA轉染到GL261和CT2A細胞中。轉染48 h后,通過RT-qPCR驗證這兩個細胞系中CACT表達水平的變化,發現si-CACT處理組相較于NC組表達水平降低(GL261:F=209.1,si-CACT-1vs.si-NC,P<0.001,si-CACT-2vs.si-NC,P<0.001,si-CACT-3vs.si-NC,P<0.001;CT2A:F=187.8,si-CACT-1vs.si-NC,P<0.001,si-CACT-2vs.si-NC,P<0.001,si-CACT-3vs.si-NC,P<0.001,圖2A、B);接下來進一步研究CACT對GBM細胞增殖和遷移能力的影響,通過平板克隆實驗發現敲低CACT可以抑制GL261和CT2A細胞的增殖能力,且差異均具有統計學意義(GL261:t=6.364,P=0.003;CT2A:t=6.399,P=0.002,圖2C);用CCK-8檢測GBM細胞的活性,研究發現在GL261和CT2A細胞系中si-CACT處理組和對照組相比其細胞活性降低(GL261:t48h=16.260,t72h=14.480,均P<0.001;CT2A:t48h=15.610,t72h=19.020,均P<0.001,圖2D、E);EdU實驗的結果也發現在GL261和CT2A細胞系中si-CACT處理組相較于NC組細胞增殖能力減弱(GL261:t=4.377,P=0.011;CT2A:t=3.276,P=0.030,圖2F、G)。劃痕實驗結果表明si-CACT組細胞愈合面積明顯減少,表明敲低CACT可以抑制GBM細胞的遷移能力(GL261:t=5.374,P=0.005;CT2A:t=6.770,P=0.002,圖2H、I)。實驗結果說明CACT可以調控GBM的生物學功能。

A～B.轉染CACT后,GBM GL261和CT2A細胞中CACT表達水平變化;C～G.敲低CACT后,對GBM GL261和CT2A細胞增殖的影響;H～I.敲低CACT后,對GBMGL261和CT2A細胞的遷移能力的影響;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖2 CACT影響GBM GL261和CT2A細胞的生物學功能

2.3 敲低CACT可以抑制GL261和CT2A細胞的CDK2和MMP-2、MMP-9表達水平 CDK2是經典的增殖相關蛋白,基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)也被認為是腫瘤細胞遷移進展的標志物。因此本課題組進一步研究了CACT在GBM細胞系中是否可以通過調控CDK2、MMP-2和MMP-9的表達變化影響GBM的生物學功能。用si-CACT處理GL261和CT2A細胞后,Western blot檢測CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的變化。發現相對于對照組,si-CACT處理組的CDK2、MMP-2、MMP-9表達水平降低(GL261:tCDK2=18.890,tMMP-2=34.580,tMMP-9=42.680,P<0.001;CT2A:tCDK2=7.769,tMMP-2=11.850,tMMP-9=12.720,P<0.001,圖3A、B。

A．GL261細胞的CDK2、MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平;B.CT2A細胞的CDK2、MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平;***P<0.001。圖3 CACT對GBM增殖和遷移相關蛋白的影響

3 討論

GBM是成年人中樞神經系統最常見的惡性腫瘤,具有惡性程度高、增殖快、侵襲性強、易復發等特點。目前常規的“手術切除+放化療”治療方案毒副作用較多,具有很大的局限性,不能令人滿意[9]。抑制腫瘤細胞的增殖和遷移是腫瘤臨床治療的主要策略,我們研究CACT對GBM細胞增殖和遷移能力的影響,并進一步探討其分子機制,望能積極探尋GBM新的腫瘤標志物及相關治療靶點。

FAO能從鄰近的脂肪組織、脂蛋白和細胞內儲存的脂肪獲得能量,而這些能量維持癌細胞的存活和增長。FAO主要發生在線粒體中,中鏈脂肪酸可以自由穿越到線粒體中,而長鏈脂肪酸則不能,長鏈脂肪酸需要與肉堿酯化,然后通過肉堿穿梭運輸到線粒體中,進行β-氧化[10]。這個過程涉及3個關鍵酶:CPTⅠ、CACT和CPTⅡ。CPTⅠ亞型CPTⅠA和CPTⅠB在人體內廣泛分布并表現出相當大的相似性,而CPTⅠC僅在大腦中表達的[11]。有學者研究表明在膀胱癌中CPTⅠB下調同時引起β-氧化受損,并促進腫瘤進展[12]。

CACT是一種線粒體膜載體蛋白,也被稱為肉堿溶質載體家族25成員20,主要參與將酰基肉堿轉運到線粒體基質中進行氧化代謝[8]。已有研究證實,CACT的缺乏會導致各種代謝性疾病如低血糖、肌無力、肝功能障礙等[13]。目前CACT在腫瘤相關方面的研究并不多,最近一項基于質譜的蛋白質組學研究表明乙肝病毒相關的肝癌患者的腫瘤組織中CACT是肝癌(HCC)具有代表性的預后蛋白之一[14]。研究證實,CACT在肝癌組織中低表達,并通過體內和體外實驗證實了過表達CACT后會抑制肝癌細胞的惡性行為,同時CACT敲低能夠抑制FAO從而促進HCC生長和轉移[8]。但是其在GBM中的生物學功能及其相關機制仍不清楚。本研究首先通過GEPIA在線數據庫分析得出相比較正常腦組織,CACT在GBM組織中的表達顯著升高,利用RT-qPCR檢測GBM癌組織和癌旁組織中CACT的表達水平,結果和GEPIA在線數據庫分析相一致。在GL261細胞和CT2A細胞中將CACT敲低后,通過平板克隆、CCK-8和EdU實驗證實,GL261和GBM新的腫瘤標志物及相關治療靶點。CT2A細胞增殖能力明顯減弱;通過劃痕實驗證實,GL261和CT2A細胞遷移能力明顯減弱。CDK2是重要的細胞增殖相關蛋白,已被證實與腫瘤的發生、發展密切相關[15]。MMP-2和MMP-9是降解Ⅳ型膠原的主要酶,能夠降解細胞外基質,在腫瘤遷移中發揮重要作用,是腫瘤細胞遷移進展相關的標記物[16]。在GL261和CT2A細胞中將CACT敲低后,與對照組相比,CACT敲低組的CDK2、MMP-2和MMP-9的蛋白表達量降低,進一步說明CACT在GBM的生物學進展中發揮重要作用。

綜上所述,本研究證實CACT可以調控GBM的發生發展,可能是GBM治療的潛在靶點。但本研究未進一步進行動物模型驗證,且相關機制研究也不夠深入,下一步將深入探究CACT在GBM細胞系中具體分子機制的調控作用。

(本論文在實驗及數據方面得到了南方醫科大學深圳醫院的大力支持,特此感謝!)