二甲雙胍促進AMPK、TFEB表達改善自噬減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

何祥運,張 藝,卞曉倩,洪 云,吳 超,王 林,李 曙

(1.皖南醫學院 病理生理學教研室,安徽 蕪湖 241002;2.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 超聲醫學科,安徽蕪湖 241001)

腦卒中是世界上第二大致死原因,更是造成傷殘的重要原因,病死率高[1]。早期恢復血流供應雖然可以減少急性腦缺血損傷,但缺血再灌注損傷不可避免。因此,探究腦缺血再灌注損傷背后的神經保護機制和治療藥物具有重要意義。

自噬是維持細胞和機體穩態的核心分子途徑[2],研究發現自噬參與許多缺血性疾病,如心肌梗死[3]、腎缺血再灌注損傷[4]和腦缺血再灌注損傷[5]等,在缺血再灌注損傷中起著重要的調控作用。AMP活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在組織細胞缺血缺氧時對自噬具有調控作用[6],可以調控細胞內自噬和溶酶體生物發生的關鍵轉錄調控因子轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)[7],從而調控細胞內自噬-溶酶體生物發生[8]。

二甲雙胍(Metformin,Met)是一種廣泛應用的雙胍類抗糖尿病藥物,可作為AMPK的激動劑[9],同時對缺血性腦卒中產生神經保護效應,但其具體作用機理尚不清楚。因此,在缺血性中風中,Met能否通過激活AMPK和TFEB調節自噬改善腦缺血再灌注損傷是一個潛在的治療方向。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注模型,探究Met在腦缺血再灌注損傷中的神經保護作用以及潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD級實驗大鼠(240～260 g)由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。27只大鼠分為3組(9只/組),①假手術組(Sham):只打開頸部用絲線穿過頸外、頸內、頸總動脈不結扎;②缺血再灌注組(I/R):缺血2 h,灌注6 h;③Met預處理組(I/R+Met):造模前21 d,大鼠腹腔注射Met 100 mg/(kg·d),持續21 d;然后進行缺血2 h,再灌注6 h。

1.2 主要材料 Met(Beyotime碧云天公司);兔多克隆抗體抗p-AMPK(Thr172)、Beclin-1、p62、LC3B(批號D4D6D、3495、D6M5X、E5Q2K,CST);兔多克隆抗體抗AMPK、GAPDH(批號AF6423、AF7021,Affinity);兔多克隆抗體抗TFEB(批號13372-1-AP,武漢三鷹生物技術有限公司);ECL化學發光底物試劑盒(BL520A,北京蘭杰柯科技有限公司)。

1.3 構建大鼠腦缺血模型 使用25%烏拉坦(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠,備皮并消毒,暴露右側頸總、頸外、頸內動脈(假手術組只分離不結扎),頸總、頸內動脈以及頸外動脈遠心端結扎,在頸外靠近頸總、頸內動脈交叉口處約5 mm剪口插入線栓,順著頸內動脈插入大腦中動脈,固定線栓。缺血2 h后取出線栓,血液再灌注規定時間后處死大鼠。

1.4 TTC染色檢測腦梗死情況 手術后取腦組織,將其置于-20℃中冷凍保存30 min,取出后行冠狀面均勻切成5片,厚度2 mm,將各切片移至培養皿中,加入TTC染液浸沒組織后,放于37℃水浴鍋孵育15 min,完成染色后,加入4%多聚甲醛固定,4℃冰箱保存,過夜后拍照。用Image Pro軟件測量腦梗死體積,梗死體積百分比為缺血半影區梗死體積與腦組織總體積之比。

1.5 HE染色觀察腦組織病理變化 術后取腦,放入4%多聚甲醛中固定24 h后,于視神經交叉處切開腦組織分為兩部分,前半部分腦組織再切為二等分,后半部分切為三等分,厚度2～3 mm,先放入全自動組織脫水機進行脫水,包埋成蠟塊,切片后放入65℃烘箱中烘干2 h,放入二甲苯中脫蠟,再放入蘇木素染液中染色(細胞核),鹽酸酒精快速脫色,放入37℃水浴鍋中水浴,伊紅染液染色(細胞質),沖洗后酒精脫水,待干后封片。

1.6 Western blot檢測相關蛋白水平 從-80℃冰箱里取出腦組織,研磨離心,取上清液,將上清液與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)混勻,98℃水浴10 min進行蛋白變性,電泳轉膜后BSA封閉1 h,加一抗p-AMPK(Thr172)、AMPK、TFEB、LC3B、Beclin-1、p62,4℃冰箱過夜,二抗孵育1 h,添加曝光液,化學發光凝膠成像系統檢測條帶。使用ImageJ軟件分析相應條帶,根據其灰度值進行統計學分析。

2 結果

2.1 AMPK表達水平在不同腦缺血再灌注時期的變化趨勢 通過構建腦缺血再灌注模型,將大鼠分成Sham組及缺血2 h再灌注0、2、6、12、24 h組,與假手術組相比,I2/R6組大鼠p-AMPK(Thr172)蛋白表達下降(P<0.05),見圖1和表1。可以確定大鼠腦組織在缺血2 h再灌注6 h后AMPK活性下降,決定使用I2/R6為大鼠腦缺血再灌注模型。

表1 各組大鼠腦組織p-AMPK(Thr172)、AMPK蛋白表達

圖1 Western blot檢測p-AMPK(Thr172)、AMPK蛋白水平

2.2 Met濃度篩選 對正常大鼠Met腹腔注射,劑量分別為0、50、100 mg/(kg·d),3周后取腦,結果顯示,與0 mg/(kg·d)組相比,50 mg/(kg·d)劑量組大鼠腦組織p-AMPK(Thr172)含量被激活(P<0.05);100 mg/(kg·d)劑量組大鼠腦組織p-AMPK(Thr172)含量升高(P<0.01)(見圖2)。決定使用100 mg/(kg·d)的劑量做后期實驗濃度。

A.蛋白電泳圖;B.p-AMPK(Thr172)蛋白表達(F=18.746,P=0.003);C.AMPK蛋白表達(F=0.911,P=0.451),與0 mg/(kg·d)組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖2 各組AMPK磷酸化蛋白水平變化

2.3 腦組織梗死情況比較 假手術組大鼠腦組織呈紅色,與假手術組相比,缺血再灌注組大腦右側有明顯的白色梗死區(P<0.001),與缺血再灌注組相比,Met預處理組大鼠右側白色梗死區明顯減少(P<0.01)。見圖3。

A.腦組織TTC染色(F=35.839,P=0.000);B.腦組織梗死體積百分比。與Sham組比較,***P<0.001;與I/R組比較,##P<0.01。圖3 各組大鼠腦組織梗死情況比較

2.4 腦組織病理學改變 假手術組大鼠大腦神經細胞形態完整,胞質、核仁清晰可見;與假手術組相比,缺血再灌注組細胞淡染,呈篩網狀,伴有細胞液化性壞死,呈空泡狀;與缺血再灌注組相比,Met預處理組細胞損傷較輕,排列較整齊,壞死細胞數量減少。見圖4。

圖4 各組大鼠大腦皮層神經細胞病理形態改變(×400,HE)

2.5 腦組織中自噬相關蛋白水平變化 與假手術組相比,缺血再灌注組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達降低(P<0.05),p62蛋白表達升高(P<0.001);與缺血再灌注組相比,Met預處理組大鼠腦組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達均升高(P<0.05),而p62蛋白表達下降(P<0.01)。見圖5。

A.蛋白電泳圖;B.LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(F=14.664,P=0.005);C.Beclin-1蛋白表達(F=8.659,P=0.017);D.p62蛋白表達(F=31.973,P=0.001);與Sham組比較,*P<0.05,***P<0.001;與I/R組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖5 各組大鼠腦組織自噬蛋白水平

2.6 AMPK、TFEB蛋白表達情況 與假手術組相比,缺血再灌注組p-AMPK(Thr172)、TFEB蛋白表達降低(P<0.05);與缺血再灌注組相比,Met預處理組p-AMPK(Thr172)、TFEB蛋白表達均增高(P<0.05);而3組AMPK蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

A.蛋白電泳圖;B.AMPK蛋白表達(F=2.783,P=0.140);C.p-AMPK(Thr172)蛋白表達(F=181.861,P<0.001);D.TFEB蛋白表達(F=9.356,P=0.014);與Sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05,###P<0.001。圖6 Met處理后p-AMPK(Thr172)、AMPK、TFEB蛋白表達水平

3 討論

目前針對腦卒中治療是恢復缺血區組織供血,在一定時間內恢復血流,大腦功能沒有得到恢復,反而導致更加嚴重的腦神經功能損傷,即為腦缺血再灌注損傷[10],其嚴重影響了腦卒中的進展與預后。Met除了其典型的降血糖作用外,可對中樞神經系統疾病,如腦缺血再灌注[11]、阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)[12]、亨廷頓病(huntington disease,HD)[13]起到神經保護作用。本研究結果表明,相比于缺血再灌注組,Met預處理組的大鼠神經細胞數量壞死減少,腦梗死區域體積減少,提示Met預處理對腦缺血再灌注損傷具有一定的神經保護效應。

研究表明自噬廣泛參與腦缺血再灌注損傷的發生發展,在缺血缺氧等應激狀態下,自噬作為機體代償影響細胞代謝,維持細胞生存環境的穩定[14]。為了明確Met在腦缺血再灌注損傷中與自噬的相關性,本研究檢測了相關自噬蛋白的表達情況,與假手術組相比,缺血再灌注組自噬減弱,Met預處理組自噬增強,提示Met預處理在大鼠腦缺血再灌注期間能夠增強細胞自噬。研究表明AMPK參與自噬過程[15],Met是AMPK的激動劑,在本研究中Met處理后AMPK活性升高,自噬增強,因此,Met通過AMPK增強自噬。AMPK可以通過多種途徑調控自噬,包括mTOR-Ulk1通路等[16-17],為了探究AMPK調控自噬的機制,我們選擇了AMPK的一個下游分子TFEB,TFEB是最初在腎癌中被發現的一種轉錄因子[18],其在神經退行性疾病中發揮著重要作用,TFEB在激活狀態下可以通過與自噬相關基因的啟動子結合,誘導自噬體形成[19]。本研究中,Met處理后TFEB的蛋白表達增強,提示AMPK可能通過TFEB調控自噬,因此,Met可以促進AMPK、TFEB的表達增強細胞自噬,減輕腦缺血再灌注損傷。本研究也存在一定的局限性,如尚未進一步驗證AMPK和TFEB的上下游關系,未來我們將通過體外實驗明確AMPK和TFEB相互關系,探究Met通過AMPK-TFEB通路調控自噬的分子機制。

綜上所述,在大鼠腦缺血再灌注中,Met預處理能夠促進AMPK和TFEB表達增強細胞自噬,改善腦缺血再灌注損傷,這可能會對預防或臨床治療腦卒中疾病中提供新的思路。