30株不同來源的金黃色葡萄球菌耐藥性及分型分析

李 玲,熊華利,蔣遠(yuǎn)婭,王 蘭

重慶市榮昌區(qū)疾病預(yù)防控制中心,重慶 462460

金黃色葡萄球菌(SAU)是醫(yī)院獲得性感染中最常見、最重要的病原體,可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、傷口感染、肺炎等多種疾病[1]。近年來,隨著抗菌藥物的廣泛使用,SAU的耐藥性逐漸顯現(xiàn)。地區(qū)政策、抗菌藥物使用習(xí)慣及用量等均會導(dǎo)致SAU的耐藥性存在地區(qū)差異[2]。了解本地區(qū)SAU的耐藥情況有益于指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥并延緩SAU耐藥性的產(chǎn)生。本文對榮昌區(qū)各級醫(yī)療機構(gòu)送檢的不同來源的樣本進(jìn)行回顧性分析,了解不同來源SAU的耐藥性并進(jìn)行分型分析,為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株源于2021-2022年榮昌區(qū)各級醫(yī)療機構(gòu)細(xì)菌耐藥監(jiān)測點送檢的分泌物、膿液、血液、鼻咽部、尿液樣本,所有送檢樣本均得到本人或家屬的知情同意,排除同一送檢對象同一部位的重復(fù)菌株,共計368份,共分離出30株SAU。

1.2儀器與試劑 (1)主要儀器:梅里埃全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(型號:VITEK2 Compact30);Vizion藥敏判讀儀;Sensititre?AIMTM藥敏接種儀;凝膠成像儀(Gel Doc XR+);脈沖場凝膠電泳儀(Mapper XA)。(2)主要試劑:葡萄球菌分離鑒定用的血瓊脂(批號:A65627)、血漿凝固酶凍干兔血漿(批號:A37662)等購自北京陸橋生物有限公司;國家致病菌識別網(wǎng)定制藥敏板CHN5GOVF(批號:B1015A)、CAMHT肉湯培養(yǎng)基(批號:359682)、Sensititre?去離子水[T3339](批號:166449)均來自Thermo廠家。耐藥性質(zhì)控菌株(糞腸球菌ATCC29212,SAUATCC29213 )。XbaⅠ內(nèi)切酶(TAKARA)、Smal內(nèi)切酶(TAKARA)、蛋白酶K(SIGMA)、溶葡萄球菌酶(SIGMA)、金膠瓊脂糖(SeaKem Gold,SKG)(Solarbio)、0.5×TBE稀釋緩沖液(Solarbio)、Gelred染色液(Solarbio)、質(zhì)控菌株H9812。所有儀器均可正常使用,所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.3方法

1.3.1SAU的分離與鑒定 參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》[3]中的方法進(jìn)行菌株的分類和鑒定,通過觀察菌落在血平板上的形態(tài)、溶血環(huán)情況、革蘭染色結(jié)果、血漿凝固酶實驗及全自動細(xì)菌生化鑒定儀結(jié)果進(jìn)行判定。

1.3.2耐藥實驗 參照國家致病菌識別網(wǎng)定制藥敏板CHN5GOVF(批號:B1015A)試劑說明書進(jìn)行操作,實驗前校準(zhǔn)比濁儀,從新鮮制備的瓊脂平板上挑取3～5個菌落,在無菌水試管中乳化,充分混勻,使用比濁儀調(diào)節(jié)到0.5 McFarland濁度;將配制好的菌懸液10 μL加入到含CAMHB肉湯培養(yǎng)基的11 mL試管內(nèi),混勻,細(xì)菌數(shù)為5.0×104～5.0×105CFU/mL。取50 μL接種液到藥敏板,進(jìn)行純度檢查,混勻,避免產(chǎn)生氣泡等;用封膜蓋上所有微孔,避免褶皺;在普通的生化培養(yǎng)箱內(nèi)34～36 ℃下孵育18～24 h,然后使用Vizion藥敏判讀儀,自動讀取結(jié)果。

1.3.3脈沖場凝膠電泳分型及聚類分析 首先將經(jīng)過18 h培養(yǎng)的菌落制成菌懸液,取250 μL菌懸液加入3 μL溶葡萄球菌酶(1 mg/mL)混勻,將菌懸液與56 ℃的1% SKG瓊脂糖等體積混勻,制備膠塊。將膠塊置于細(xì)胞裂解液,54 ℃裂解60 min,然后用超純水和TE緩沖液清洗。切下2 mm寬的膠塊,標(biāo)準(zhǔn)株H9812用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ在37 ℃,SAU用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ在30 ℃進(jìn)行酶切3～4 h,酶切后的膠塊用于脈沖場凝膠電泳。設(shè)置電泳參數(shù):初始轉(zhuǎn)換時間=4.0 s,終末轉(zhuǎn)換時間=40.0 s,4 cm×13 cm的膠電泳時間為19 h,電場強度=6 V/cm,電場夾角=120°。電泳結(jié)束后,Gelred染料染色30 min,純水中脫色60 min,凝膠成像儀生成指紋圖譜保存。用BioNumeric生物分析軟件對30株SAU的指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布及SAU檢出情況 368份菌株標(biāo)本中痰液標(biāo)本182份,占49.46%,其次是分泌物、膿液、血液、鼻咽部、尿液樣本,分別占19.57%、11.96%、8.70%、6.79%、3.53%;共檢出SAU 30株,檢出率為8.15%(30/368),主要來自痰液標(biāo)本(16株,占53.33%),其次是分泌物標(biāo)本(6株,占20.00%)和膿液標(biāo)本(4株,占6.67%)。見表1。

表1 菌株分布及SAU檢出情況

2.230株SAU耐藥情況分析 耐藥實驗發(fā)現(xiàn),30株不同來源的SAU對青霉素耐藥率為100.00%,對紅霉素(60.00%)、克林霉素(40.00%)、四環(huán)素(36.67%)、頭孢西丁(30.00%)、苯唑西林(26.67%)、左氧氟沙星(16.67%)、慶大霉素(13.33%)、呋喃妥因(3.33%)、利福平(3.33%)均產(chǎn)生一定程度的耐藥性;未檢出對替考拉寧、萬古霉素、達(dá)托霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、利奈唑胺、紅霉素/克林霉素的耐藥菌株。見表2。

表2 30株SAU耐藥情況(n=30)

2.3脈沖場凝膠電泳分型結(jié)果 30株SAU經(jīng)酶切、電泳后,將指紋圖譜導(dǎo)入BioNumeric生物分析軟件進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示有3株SAU相似度為100.00%。見圖1。

圖1 30株SAU聚類分析圖

3 討 論

SAU在自然界中廣泛存在,為機會致病菌,可引起醫(yī)院和社區(qū)感染[4],對臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)。SAU耐藥性的產(chǎn)生,已成為重要的公共衛(wèi)生問題[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn),2021-2022年榮昌區(qū)SAU的檢出率為8.15%,略低于2016-2019年東莞市22家醫(yī)療機構(gòu)平均水平(8.42%)[2],低于樊芙蓉等[7]報道的某醫(yī)院SAU檢出率(9.30%),也低于2018年中國SAU平均檢出率(34.00%)[8],分析原因:(1)2021-2022年新型冠狀病毒感染肺炎流行,醫(yī)院內(nèi)部常態(tài)化消毒工作可能造成SAU檢出率較低;(2)不同醫(yī)生對藥物的使用習(xí)慣、藥物用量存在差異;(3)不同醫(yī)院的院感管理政策和管理力度也存在差異,以上原因都可能造成醫(yī)院SAU檢出率的差異。

本研究30株SAU菌株主要來自痰液,其次是分泌物和膿液,提示榮昌區(qū)SAU主要是來自傷口感染和呼吸道感染、與陳日壽等[2]、楊媚等[9]報道結(jié)果相似。近年來,隨著抗菌藥物在醫(yī)院的廣泛應(yīng)用及居民的自我用藥比例的不斷提升,SAU不斷對各類藥物產(chǎn)生耐藥性[10]。本研究30株SAU菌株中,對青霉素的耐藥率為100.00%,高于東莞市2019年青霉素的耐藥率(87.30%)[2],也高于楊媚等[9]的報道(青霉素耐藥率>94.10%),提示青霉素可能已不再適用于SAU的臨床治療,應(yīng)盡量避免該類藥物,以減輕患者反復(fù)感染和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。30株SAU菌株中,對紅霉素的耐藥率為60.00%,高于東莞市2016-2019歷年平均水平(45.70%、47.40%、43.00%、42.60%)[2],低于CHEN等[10]報道的江西省某教學(xué)醫(yī)院2008-2013年平均水平,提示紅霉素的耐藥性應(yīng)予以足夠重視,進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。SAU對克林霉素、四環(huán)素、頭孢西丁、苯唑西林、左氧氟沙星、慶大霉素、呋喃妥因、利福平的耐藥率相對相低,未檢出對替考拉寧、萬古霉素、達(dá)托霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、利奈唑胺、紅霉素/克林霉素的耐藥菌株,與文獻(xiàn)[2,9]報道類似,說明該類藥物對于SAU還具有良好的抗菌活性。但陳日壽等[2]、CHEN等[10]等發(fā)現(xiàn),隨著時間的推移,SAU的耐藥性都會發(fā)生一定的趨勢變化。由此可見,開展SAU的耐藥性監(jiān)測,動態(tài)掌握SAU的耐藥情況,對于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。本研究脈沖場凝膠電泳分型結(jié)果顯示,有3株SAU相似度為100.00%,通過查閱送檢資料,為同一患者不同類型的標(biāo)本,提示在醫(yī)院或者社區(qū)中,可能暫未發(fā)生聚集性感染的情況。

綜上所述,榮昌區(qū)SAU檢出率相對較低,但對多種抗菌藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性,應(yīng)進(jìn)一步加強對SAU的耐藥性監(jiān)測,加強抗菌藥物的管理應(yīng)用,動態(tài)掌握SAU耐藥性的變化,以便更科學(xué)地指導(dǎo)臨床用藥。