腦脊液ctDNA活檢在髓母細胞瘤的研究進展*

陳欣彤 綜述,盛漢松 審校

溫州醫科大學附屬第二醫院神經外科,浙江溫州 325000

髓母細胞瘤(MB)是一種常見于兒童小腦或后顱窩的高侵襲性惡性腫瘤,占所有兒童顱內腫瘤的10%～20%。隨著分子生物學的發展,MB根據基因表達譜至少可以分為4種分子亞型:WNT、SHH、Group3和Group4[1-2],近年來也有不少研究表明可將這些亞型分為更詳細的亞組[3-4]。兒童MB主要根據分子亞型確定危險度分層及預后[2,5]。因此,MB的診斷、預后和治療靶點的確定依賴于腫瘤的分子特征[2]。目前臨床上主要通過組織活檢來表征,但這種方式存在一定的局限性:由于其具有侵入性,組織活檢的使用會受限于腫瘤的位置、大小等;通過隨機和局部的組織活檢獲得的樣本可能會遺漏腫瘤異質性;腫瘤基因組特征可能隨著腫瘤發展而動態演變,在腫瘤治療過程中或復發時,無法隨時進行組織活檢獲取腫瘤信息,使臨床診療的精確性受到限制[6-8]。循環腫瘤DNA(ctDNA)的腦脊液活檢有可能克服上述局限,它能以一種侵入性較小的形式,通過識別和驗證腫瘤生物標志物,提供實時信息以幫助診斷和監測中樞神經系統(CNS)惡性腫瘤[9]。在本綜述中,筆者將概述腦脊液ctDNA活檢在MB中的研究進展,討論其潛在的臨床應用價值及轉化為臨床實踐工具需要克服的挑戰。

1 腦脊液ctDNA

細胞游離DNA(cfDNA)是指由細胞脫落到生物體液中的DNA片段,其中由腫瘤細胞脫落的cfDNA即為ctDNA。ctDNA主要來自凋亡和壞死的腫瘤細胞,也可以由原發腫瘤中的任何細胞及其轉移性病變釋放[6]。多項研究表明腦脊液是ctDNA的可靠來源,在診斷CNS腫瘤方面比血漿或血清更有優勢[10-11]。ctDNA可以根據健康細胞DNA中未發現的腫瘤特異性突變與cfDNA進行區分,提供高特異性的生物標志物。隨著腫瘤的生長,細胞更新速率加快,釋放出更多的ctDNA,因此ctDNA豐度的縱向監測為評估腫瘤負荷提供了可追溯的生物標志物,并且鑒于ctDNA的半衰期相對較短(約2 h),通過ctDNA分析實時監測腫瘤反應具有可行性[6,12]。

腦脊液ctDNA的檢測過程主要為腦脊液樣本收集,離心處理后通過核酸試劑盒提取與純化DNA,繼而采用ctDNA的檢測和分析技術,如新一代測序(NGS)技術、數字聚合酶鏈反應(PCR)技術、BEAMing技術進行DNA測序,對腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學改變(如基因突變、擴增、重排、甲基化等)進行定量分析[8,13-15]。目前,ctDNA常用檢測方法主要分為靶向和非靶向兩大類。靶向方法檢測特定的、已知分子變化的靶向ctDNA,常使用基于PCR的技術或采用靶向基因測序,如數字PCR技術、BEAMing技術,能檢測到極低水平ctDNA中的突變,靈敏度高,適用于初始診斷和分子腫瘤分類,但受到檢測突變數量的限制;非靶向方法一般采用全基因組或全外顯子組測序,如NGS技術,能同時檢測多個基因的多種變異,也包括腫瘤分子譜未知的ctDNA突變,適用于分析播散和轉移性腫瘤隨時間變化的基因組表現[6,16-18]。

2 ctDNA腦脊液活檢用于診斷MB的臨床價值

2.1輔助MB診斷、分類及預后預測 腦脊液ctDNA的突變能高度體現腫瘤組織的基因型,可用于腫瘤的病理分型,協助診斷MB,并通過分子分型結合患者年齡、手術切除程度、有無轉移、組織病理類型輔助對MB的危險度進行分層[2],進而預測MB患者的預后。MB亞組主要通過分析與其相關的突變基因(BCOR、CTDNEP1、CTNNB1、DDX3X、GFI1、GFI1 act、GFI1B act、KBTBD4、KDM6A、KMT2C、KMT2D、PRDM6 act、PTCH1、SMARCA4、SMO、SUFU、TERT、TERT啟動子、TP53、ZMYM3等)、染色體拷貝數變異(CNV,包括GLI2、MYC、MYCN、OTX2擴增,PTEN、SUFU 缺失等)及細胞遺傳學特征(如1q+,2+,4-,5+,6-,7+,8-,8+,9p+,9q-,10-,10q-,11-,13-,13+,14+,14q-,15-,16-,16q-,17p-,17p+,18+,21-)進行分類[10,19]。ESCUDERO等[10]研究表明腦脊液ctDNA概括了原發性腫瘤中存在的腫瘤內異質性及腫瘤突變負荷,對于腦脊液細胞學結果陰性的患者,腦脊液中的ctDNA水平比血漿中的更高,并且腦脊液ctDNA的外顯子組測序發現在原發性腫瘤樣本中檢測到的突變也可以在匹配的腦脊液ctDNA中檢測出,二者的變異等位基因頻率具有顯著相關性。研究中檢測到的基因組改變包括MB常見突變(PTCH1、TP53)、CNV(MYCN和GLI2擴增)和臂級染色體畸變(染色體17p丟失),表明ctDNA分析能為MB分子診斷與危險度分層提供充足的信息。LIU等[20]利用MB染色體不穩定性的優勢將腦脊液cfDNA中CNVs作為可測量殘留病灶(MRD)標志物,在67例基線樣本[63.81%(67/105)]中檢測到MRD,且與相應的原發性腫瘤CNV譜呈高度相關。此外,有研究發現基線樣本中MRD的可檢測性與年齡、性別、切除范圍、細胞學表現及從切除到腦脊液取樣的持續時間無關,但與MB風險分組、轉移狀態、分子亞組和腫瘤位置顯著相關,這些因素又具體表現在MB的危險度分層中[20-21]。腦脊液ctDNA輔助MB診斷與危險度分層,繼而為MB的預后提供預測信息,有研究表明雖然基線MRD的可檢測性無顯著預后價值,但放療后、化療中期或治療結束時的連續MRD評估與患者的無進展生存時間顯著相關,無論初始風險分組如何,在輔助治療期間或結束時持續的MRD陽性能高度預測疾病進展情況,反之,早期(例如在放療后的時間點)MRD陰性則可以作為治療降級的附加標準[20]。因此,相較于傳統的組織活檢分析分子特征的方法,腦脊液ctDNA能較全面、動態地反映腫瘤的基因組特征,從而輔助MB的診斷、分類與預后預測。

2.2監測治療反應、腫瘤進展與復發 在患者隨訪期間,通過監測ctDNA水平和MRD,有助于評估治療反應與腫瘤進展。ESCUDERO等[10]通過縱向分析腦脊液ctDNA、檢測MRD,確定了腫瘤內和病灶間的異質性,揭示了腫瘤在復發時的基因組轉化;通過對MB患者術前、術后及隨訪時的腦脊液ctDNA分析發現,在治療結束時腦脊液樣本中仍然觀察到少量ctDNA,表明腦脊液ctDNA分析可以檢測到患者體內殘留的小結節,并且在部分通過磁共振成像未觀察到的樣本中也能檢測到。LIU等[20]研究發現,50%的患者通過MRD檢測到的病情進展比放射學檢測到的早3個月以上,即MB中ctDNA的增加先于放射學進展,表明腦脊液ctDNA可以彌補影像技術檢測的滯后性,促進MB患者中MRD的鑒定。

MB復發或轉移的患者,腦脊液ctDNA中檢測到的MB相關改變比來自腫瘤組織的基因組DNA更豐富,具有與原發腫瘤不共有的分子譜[10,20-21]。ESCUDERO等[10]分析腦脊液ctDNA發現,除檢測到腫瘤特異性突變(常見的4個預測驅動因素包括PTCH1:p.L1024Pfs,TP53:p.N239Tfs,CDKN2B:p.G124D,KMT2A:p.W1199S)外,還檢測到其他突變,揭示了復發時腫瘤的基因組轉化。LIU等[20]對有疾病進展及在早期時間點與疾病進展時MRD均陽性的患者進行腦脊液與腫瘤樣本匹配的CNV譜分析發現,80.00%患者(12/15)的染色體非整倍性存在,提示染色體克隆選擇或進化,其中2例患者在原發腫瘤與基線ctDNA比較的亞群中檢測到不同CNV譜,并且ctDNA的CNV譜與復發腫瘤更一致,提示患者基線時的腦脊液樣本包括驅動疾病進展的侵襲性亞克隆。因此,ctDNA分析可能更真實地代表最終驅動疾病進展的惡性細胞基因組信息,對腫瘤進展與復發的診斷有補充作用,有助于在復發時調整治療策略。

MB還呈現異常DNA甲基化改變的表觀遺傳學特征[7],腦脊液ctDNA分析可以檢測到具有診斷和預后價值的DNA甲基化標志物。LI等[22]分析了MB患者腦脊液ctDNA基因組中的表觀遺傳標志,包括DNA甲基化和羥甲基化,表明腦脊液ctDNA還可以進行表觀遺傳學分析,在ctDNA中鑒定的DNA甲基化標志具有潛在的診斷和預后價值,并且腦脊液樣品中的DNA甲基化的變化可用于監測治療反應和腫瘤復發。

3 ctDNA腦脊液活檢用于診斷MB面臨的挑戰

首先是腦脊液獲取方面的挑戰。腦積液抽取在患有后顱窩腫瘤(如MB)的兒童中較為常見,需在手術治療前進行腦脊液外引流以減輕顱內壓,并在MB臨床診療過程中,常規收集腦脊液樣品用于細胞學分析,因此腦脊液樣本的獲取對MB患兒一般不會造成額外傷害,且獲取腦脊液的侵入性明顯低于手術。但通過腰椎穿刺的方式獲取腦脊液也存在一定限制,其禁忌證包括顱內壓異常、腦疝風險和凝血異常等[9]。

其次,收集和處理腦脊液ctDNA的方法尚需標準化和優化[23],如樣本采集的日期,尤其是術后采集日期,因為創傷誘導的cfDNA在手術后長達4周內豐度可能會稀釋ctDNA的比例,進而影響檢測結果[24];樣本量也會影響ctDNA的檢測結果[6];溫度、儲存條件等因素會影響ctDNA的完整性[25]。

此外,ctDNA并未在所有CNS惡性腫瘤患者的腦脊液中檢測到,其檢測結果可能受腫瘤負荷、腫瘤進展和解剖位置的影響[20-21],尚需進一步擴大研究范圍、確定檢測涉及的影響因素以及提高檢測技術的敏感性[9]。影像學檢查技術有時反映出的“腫瘤進展”可能是治療引起的炎癥反應過程,即假性進展[26],尚需進一步的研究來調查腦脊液ctDNA分析是否有助于區分真實進展和假性進展。

4 總結與展望

目前腫瘤分子特征的分析已成為確定MB類型、預后以及治療靶點的重要組成部分。腦脊液ctDNA分析從降低侵入性、更全面反映腫瘤異質性、樣本獲取的方便性等方面彌補了組織活檢的不足,對MB的臨床管理有潛在價值。腦脊液ctDNA分析可以反映MB的基因組特征,輔助MB早期、準確的分子診斷(包括亞型和危險度分層)與預后預測,腦脊液ctDNA分析還可以動態監測患者的疾病進展,提供有關MRD、腫瘤演變和復發時的基因組信息。但ctDNA腦脊液活檢尚面臨處理方法標準化、檢測技術優化等方面的挑戰,因此有必要進行更大隊列的研究,從優化檢測技術、確立活檢的納入、處理與分析標準等方面解決腦脊液ctDNA分析向臨床轉化的困難,最終為MB患者提供更便捷、精準的臨床管理等醫療服務。