NSCLC患者胸腔積液ROS1、EGFR基因突變與臨床病理及靶向治療的關系研究

伍秉翔,楊雪榮,劉 龍△

上海天佑醫院:1.腫瘤科;2.中醫科,上海 200061

國際癌癥研究機構2018年公布的數據顯示,在全球惡性腫瘤中,肺癌發病率為11.6%,病死率為18.4%,均排在首位[1]。我國國家癌癥報告中也指出,肺癌發病率與病死率在惡性腫瘤中占比最高[2]。根據病理分型,肺癌可分為小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC),后者在肺癌中占比約為80.0%,主要為腺癌、鱗癌等[3]。盡管臨床診治惡性腫瘤均獲得了一定進展,但多數肺癌患者在確診時已發展至中晚期,此時難以進行手術治療。近年來,分子生物學技術的快速發展使特異性分子靶向治療在臨床惡性腫瘤治療中應用增多。分子靶向治療具有高度特異性,能夠更好地作用于腫瘤特定位點,選擇性殺死腫瘤細胞,有利于改善肺癌患者預后[4]。在分子靶向治療中,以肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)、表皮生長因子受體(EGFR)等為靶點的靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)應用較多,但并非所有患者均可從TKI治療中獲得滿意效果,ROS1、EGFR基因突變是TKI藥物靶向治療的前提條件[5]。有研究指出,EGFR基因突變與患者性別、病理分型等有關[6]。因此了解NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變情況,并對患者特征進行分析總結,對指導臨床治療具有重要意義。因NSCLC患者確診時多處于中晚期,大多不符合手術要求,而穿刺標本取樣少,加之腫瘤組織本身具有異質性,故需尋找其他方法來完成檢測。胸腔積液的獲取安全性相對較高,實時性強,可作為ROS1、EGFR基因突變檢測的生物學材料。本研究檢測了NSCLC患者胸腔積液中ROS1、EGFR基因突變情況,并分析了胸腔積液ROS1、EGFR基因突變與患者臨床特征及治療效果的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年10月至2021年2月上海天佑醫院收治的285例NSCLC患者,其中有197例患者采用靶向治療(靶向治療組),88例患者采用傳統化療(化療組)。納入標準:(1)符合《腫瘤綜合診療新進展》[7]中NSCLC相關的診斷標準,且經病理學檢查確診;(2)在進行胸腔積液ROS1、EGFR基因突變檢測前未行放化療;(2)臨床資料完整。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)心、肝、腎功能不全;(3)合并免疫系統疾病。

1.2方法

1.2.1治療方法 (1)靶向治療:口服厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司)150 mg/d,連續治療2個月。(2)化療:順鉑(江蘇豪森藥業集團有限公司)70 mg/m2,第1天靜脈滴注;吉西他濱(南京正大天晴制藥有限公司)1 000 mg/m2,第1、8天靜脈滴注;每21天為1個周期,連續治療2個周期。

1.2.2檢測方法

(1)胸腔積液ROS1、EGFR提取。取經細胞學檢查確定有癌細胞的胸腔積液50 mL,4 ℃保存并于24 h內進行DNA提取及基因檢測。于4 ℃環境中3 000 r/min離心10 min;吸取上清液,再在4 ℃環境中3 000 r/min離心10 min;吸取上清液加入Buffer SPL和蛋白酶K溶液,于63 ℃水浴消化。加入DNA示蹤劑、異丙醇,1 000 r/min離心5 min。清洗2次,1 000 r/min離心5 min,收集DNA。采用廈門艾德生物醫藥科技有限公司生產的人類ROS1融合基因檢測試劑盒與EGFR基因突變檢測試劑盒進行檢測,檢測儀器為ABI7500儀器,檢測方法為突變擴增系統-聚合酶鏈反應(ARMS-PCR)。離心機為美國Beckman Coulter公司Allegra 64R臺式高速冷凍離心機。

(2)ROS1基因檢測。于-20 ℃冰箱中取出ROS1混合酶和N(ROS1樣本數)條8聯PCR反應管條,均離心15 s。移取1.5 μL ROS1混合酶至待測樣本cDNA、陽性及陰性對照中,振蕩混勻后快速離心10 s。進行PCR擴增,擴增條件:第1階段95 ℃ 5 min;第2階段95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環;第3階段93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,35個循環。

(3)EGFR基因檢測。于-20 ℃冰箱中取出EGFR混合酶和N(EGFR樣本數)+2條8聯PCR反應管條,均離心15 s。稀釋DNA,加入2.7 μL EGFR混合酶,振蕩后離心。行PCR擴增,擴增條件:第1階段95 ℃ 5 min;第2階段95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環;第3階段93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,35個循環。

1.2.3基因檢測結果判讀 ROS1基因檢測位點包含SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1、SDC4-ROS1、EZR-ROS1、TPM3-ROS1、LRIG3-ROS1、GOPC-ROS1,若未檢測到上述突變則認為ROS1融合陰性。EGFR基因檢測位點包含19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I、L861Q。因EGFR基因除18～21外顯子外的突變極少見且目前與用藥不相關,故如果未檢測到上述突變則判斷為EGFR野生型。

1.3療效評價 采用實體瘤臨床療效評價標準(RECIST)評價治療效果,分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)。客觀緩解率(ORR)=(CR例數+PR例數)/總例數×100.00%,疾病控制率(DCR)=(CR例數+PR例數+SD例數)/總例數×100.00%。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗或連續性校正χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NSCLC患者胸腔積液ROS1、EGFR基因突變情況 NSCLC患者胸腔積液ROS1基因突變率為3.51%(10/285),EGFR基因突變率為41.05%(117/285)。在ROS1基因突變中,SLC34A2-ROS1占比最高,其次為CD74-ROS1;在EGFR基因突變中,19-Del占比最高,其次為L858R。見表1。

表1 NSCLC患者胸腔積液ROS1、EGFR基因突變類型[n(%)]

2.2NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變與臨床特征的關系 女性NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于男性NSCLC患者(P<0.05);腺癌NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于非腺癌NSCLC患者(P<0.05);無吸煙史NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于有吸煙史NSCLC患者(P<0.05);但不同年齡、腫瘤最大徑、解剖學部位、初診TNM分期患者ROS1、EGFR基因突變率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變與臨床特征的關系[n(%)]

2.3伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較 伴ROS1基因突變的NSCLC患者中,靶向治療組ORR、DCR與化療組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較[n(%)]

2.4伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較 伴EGFR基因突變的NSCLC患者中,靶向治療組ORR、DCR均高于化療組(P<0.05)。見表4。

表4 伴有EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較[n(%)]

2.5伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應比較 伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療組不良反應發生率與化療組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應比較[n(%)]

2.6伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應比較 伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療組惡心/嘔吐、肝損害、骨髓抑制的發生率均低于化療組(P<0.05)。見表6。

表6 伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應比較[n(%)]

3 討 論

外科手術、放化療、免疫治療是NSCLC治療的常用手段,但由于多數患者確診時已經處于癌癥中晚期,故化療使用更多。然而化療不具有特異性,其在殺死腫瘤細胞的同時也會對正常細胞造成損害,引起明顯不良反應。隨著分子生物技術的不斷發展,分子靶向治療NSCLC逐漸興起,與放化療相比較,其可減少不良反應,更好地延長患者生存期。與NSCLC相關的基因較多,其中ROS1、EGFR基因為目前臨床研究較多的驅動基因,本次研究選取上述2種基因,分析其在NSCLC患者胸腔積液中的突變率,并探討了伴ROS1、EGFR基因突變的NSCLC患者臨床特征和治療效果。

ROS1為單體型受體酪氨酸激酶,人ROS1基因定位于6q21染色體中,其發生重排時會丟失細胞外區域,重排位點主要見于32～36外顯子[8]。有研究顯示,NSCLC中ROS1基因主要和CD74、SLC34A融合,可促使下游JAK/STAT、PI3K/AKT等信號通路呈持續激活狀態,繼而促進腫瘤發生[9-10]。有研究顯示,ROS1染色體重排在NSCLC中較少見,僅為1%～2%[11-12]。劉光峨等[13]對黔北地區NSCLC患者ROS1基因突變進行檢測,顯示ROS1基因突變率為1.2%。吳丹等[14]研究顯示,NSCLC患者ROS1基因突變率為2.7%。本研究結果顯示,285例NSCLC患者胸腔積液ROS1基因突變率為3.51%(10/285),略高于以往研究,可能與患者居住地、生活習慣有關。EGFR基因位于第7號常染色體7p12-14區,是人表皮生長因子受體家族成員之一,其發生突變或異常高表達均能夠引發腫瘤[15]。EGFR基因突變主要區域為TK區域18～21外顯子[16],本研究中,EGFR基因突變率為41.05%(117/285),19-Del占比最高(48.72%),其次為L858R(38.46%)。魯濤等[17]研究顯示,NSCLC患者胸腔積液EGFR基因突變率為54.5%,且突變類型以19-Del、L858R為主,可見盡管不同研究中NSCLC患者EGFR基因突變率存在差異,但總體而言EGFR基因突變率較高,且主要類型為19-Del、L858R。

有研究顯示,ROS1、EGFR基因突變與性別、組織類型、地域等有關,多數ROS1、EGFR基因突變陽性者為女性、腺癌、東亞人群[18-19]。本研究結果中,女性、腺癌、無吸煙史的NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于男性、非腺癌、有吸煙史的NSCLC患者(P<0.05),但不同年齡、腫瘤最大徑、解剖學部位、初診TNM分期ROS1、EGFR基因突變率比較,差異均無統計學意義(P>0.05),提示性別、病理分型和吸煙史與ROS1、EGFR基因突變有關。ROS1、EGFR基因突變是造成患者預后不良的影響因素之一,采用分子靶向藥物治療存在ROS1、EGFR基因突變位點的患者,可以減少不良反應,有效提升患者治療耐受性和生存質量,延長其無進展生存期。本研究對采用靶向治療或化療的伴有ROS1、EGFR基因突變的NSCLC患者治療效果進行觀察分析,發現ROS1基因突變陽性患者中,靶向治療組ORR、DCR分別為42.86%、71.43%,高于化療組的0.00%、33.33%,但差異無統計學意義(P>0.05),這可能與例數太少有關,提示通過靶向治療有提高伴ROS1基因突變NSCLC患者的療效的可能。EGFR基因突變陽性患者中,靶向治療組ORR、DCR分別為61.25%、80.00%,高于化療組的32.43%、51.35%,差異均有統計學意義(P<0.05),表明EGFR基因突變陽性患者采用靶向治療可獲得更好的效果。筆者還對治療不良反應進行分析,顯示伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療組與化療組不良反應發生率比較,差異無統計學意義(P>0.05),伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療組惡心/嘔吐、肝損害、骨髓抑制不良反應發生率均低于化療組(P<0.05),提示伴有EGFR基因突變陽性的NSCLC患者行靶向治療可以降低不良反應發生率。雖然本次研究中胸腔積液EGFR基因突變檢測結果沒有對應的腫瘤組織檢測結果予以對比驗證,但是該檢測結果指導下的靶向治療效果與過去在腫瘤組織檢測結果指導下的靶向治療效果相符[20],間接說明了在病理質控把關前提下的胸腔積液EGFR突變檢測結果準確可靠,有確切的臨床價值。

綜上所述,NSCLC患者胸腔積液檢測可見ROS1、EGFR基因突變,其突變率分別為3.51%、41.05%,ROS1、EGFR基因突變與患者性別、病理分型和吸煙史等臨床特征有關,且EGFR基因突變和療效、不良反應存在關系。檢測NSCLC患者胸腔積液能夠有效指導NSCLC患者靶向治療。本次研究也存在不足之處,納入樣本量相對較少,使ROS1基因突變陽性病例少,對研究結果會產生一定影響,還有待后續擴大樣本量研究。