丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒抗體滴度、miR-27a和miR-130a水平及意義

宋娟芳,李 源

陜西省西安市北方醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西西安 710043

丙型肝炎是丙型肝炎病毒(HCV)感染機(jī)體所導(dǎo)致的病毒性肝炎。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,HCV屬于世界范圍內(nèi)的感染性疾病,除東歐外,1990-2017年全球HCV感染年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率逐漸下降[1]。在我國(guó),丙型肝炎是發(fā)病率僅次于乙型肝炎的病毒性肝炎[2]。慢性HCV感染有進(jìn)展為肝硬化的風(fēng)險(xiǎn),約28.0%肝硬化由HCV感染所引發(fā)[3],而肝硬化存在較高肝細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]。做好丙型肝炎肝硬化的準(zhǔn)確診斷對(duì)預(yù)后改善有重要作用。HCV抗體(HCV-Ab)是機(jī)體遭受HCV感染后所產(chǎn)生的抗體,是HCV感染的主要診斷指標(biāo)之一。以往在乙型肝炎病情研究中發(fā)現(xiàn),乙型肝炎病毒核心抗體定量檢測(cè)值與乙型肝炎炎癥程度和纖維化相關(guān),故臨床可通過定量測(cè)定乙型肝炎病毒核心抗體水平判斷肝臟損傷程度,同時(shí)為疾病治療提供依據(jù)[5-6]。但在丙型肝炎中HCV-Ab是否存在與乙型肝炎相似狀態(tài),目前尚缺少數(shù)據(jù)報(bào)道。微小RNA(miRNA)是一類廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及病毒感染等過程的小分子肽,其中miRNA-27a(miR-27a)位于19p13.13號(hào)染色體,具有促炎癥反應(yīng)、促血管生成、調(diào)控細(xì)胞增殖分化等功效;miRNA-130a(miR-130a)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子,可通過與靶基因上的信使RNA選擇性結(jié)合,抑制其表達(dá),從而參與真核生物組織發(fā)育、細(xì)胞分化及免疫調(diào)控等生理變化。以往研究顯示,miR-27a在乙型肝炎患者體內(nèi)高表達(dá),是影響乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化和肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7];miR-130a在乙型肝炎病毒感染患者體內(nèi)呈高表達(dá),尤其是隱匿性乙型肝炎患者,對(duì)隱匿性乙型肝炎病毒感染具有一定診斷價(jià)值[8],但關(guān)于其在丙型肝炎患者體內(nèi)表達(dá)狀態(tài)及意義尚未明確。本研究檢通過測(cè)定丙型肝炎患者血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a水平,分析其與HCV肝損傷情況的相關(guān)性,以期為患者臨床診治提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2022年6月在西安市北方醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)就診的152例丙型肝炎患者為觀察組,另選取同期在本院體檢中心接受常規(guī)體檢的健康人群152例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):觀察組符合《丙型肝炎防治指南(2019年版)》[9]中有關(guān)丙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn);無凝血功能障礙;臨床資料完整;非過敏體質(zhì);精神正常,能配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn):被確診為乙型、戊型肝炎病毒感染;合并其他原因所致肝病;合并其他類型局部或全身性感染;近6個(gè)月內(nèi)接受過干擾素、核苷酸類或免疫調(diào)節(jié)劑治療;合并惡性腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病。觀察組男83例,女69例;年齡33～69歲,平均(57.15±8.16)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為19.45～29.13 kg/m2,平均(23.76±3.97)kg/m2。對(duì)照組男77例,女75例;年齡35～70歲,平均(56.64±8.17)歲;BMI為18.69～30.13 kg/m2,平均(23.77±3.95)kg/m2。兩組受試者性別、年齡、BMI比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究符合本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核標(biāo)準(zhǔn)。所有受試者均簽署知情協(xié)議書。

1.2方法

1.2.1血清指標(biāo)測(cè)定 取兩組受試者晨起空腹肘靜脈血3～5 mL,3 000/min離心10 min,留取上清液待用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定觀察組HCV-Ab滴度,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定觀察組血清HCV-DNA載量和兩組血清miR-27a、miR-130a表達(dá)水平(2-△△Ct法計(jì)算)。

1.2.2肝臟損傷程度評(píng)估 觀察組于入院后3 d內(nèi)在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行肝穿刺活檢,獲取5個(gè)及以上完整匯管區(qū)長(zhǎng)度1.0～2.0 cm的肝組織標(biāo)本,10%甲醛溶液固定,制作石蠟切片,蘇木精-伊紅染色,采用Scheuer評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估患者肝臟炎癥分級(jí)和纖維化分期情況。(1)炎癥分級(jí):G0級(jí)為肝臟匯管區(qū)、肝小葉及周圍均無炎癥;G1級(jí)為匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥病變,肝小葉有肝細(xì)胞變性和少數(shù)點(diǎn)狀或灶狀壞死;G2級(jí)為匯管區(qū)及周圍均有輕度碎屑狀壞死,肝小葉內(nèi)細(xì)胞變性,出現(xiàn)點(diǎn)狀和灶狀壞死或嗜酸性小體;G3級(jí)為匯管區(qū)及周圍中度碎屑狀壞死,肝小葉變性,呈現(xiàn)融合壞死或橋接壞死;G4級(jí)為匯管區(qū)及周圍重度碎屑狀壞死,大范圍橋接壞死,多小葉壞死。(2)纖維化分期:S0期為無纖維化;S1期為匯管區(qū)無纖維化,但肝小葉和肝竇內(nèi)現(xiàn)纖維化;S2期為匯管區(qū)周圍呈現(xiàn)纖維化,且形成纖維間隔,但保留小葉結(jié)構(gòu);S3期為纖維間隔和小葉結(jié)構(gòu)均紊亂,但尚未現(xiàn)肝硬化結(jié)節(jié);S4期為肝硬化[10]。

2 結(jié) 果

2.1兩組受試者血清miR-27a、miR-130a水平比較 觀察組患者miR-27a、miR-130a水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組受試者血清miR-27a、miR-130a水平比較

2.2觀察組血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a與HCV-DNA載量的相關(guān)性 觀察組患者HCV-DNA載量為0.86～3.17 IU/mL,平均(1.75±0.44)IU/mL。Pearson相關(guān)分析顯示,觀察組血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a均與HCV-DNA載量呈正相關(guān)(r=0.325、0.365、0.427,P<0.001)。見圖1。

注:A為血清miR-27a與HCV-DNA載量相關(guān)性散點(diǎn)圖;B為血清miR-130a與HCV-DNA載量相關(guān)性散點(diǎn)圖;C為血清HCV-Ab滴度與HCV-DNA載量相關(guān)性散點(diǎn)圖。

2.3觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟炎癥分級(jí)的相關(guān)性 不同炎癥程度患者血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);肝臟炎癥G4級(jí)患者的血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平高于G3級(jí)、G2級(jí)和G1級(jí)(P<0.01)。見表2。

表2 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟炎癥分級(jí)的關(guān)系

2.4觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟纖維化的關(guān)系 不同纖維化程度患者血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);肝臟纖維化S4期者的血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平高于S2～S3期、S1期和S0期(P<0.01)。見表3。

表3 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟纖維化情況的關(guān)系

2.5血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平預(yù)測(cè)肝硬化的效能 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平是發(fā)生丙型肝炎肝硬化的影響因素(P<0.05)。見表4。根據(jù)是否發(fā)生肝硬化,得回歸方程為Y=-20.020+1.340×XHCV-Ab+1.197×XmiR-27a+1.061×XmiR-130a。3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)丙型肝炎患者發(fā)生肝硬化的曲線下面積(AUC)明顯高于血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a單獨(dú)檢測(cè)(Z=2.083、2.474、2.902,P<0.01)。見圖2、表5。

圖2 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)肝硬化的ROC曲線

表5 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)肝硬化的效能

3 討 論

HCV感染后自然轉(zhuǎn)陰率較低,70.0%～80.0%急性HCV感染會(huì)轉(zhuǎn)化為慢性肝炎。慢性肝炎是引發(fā)肝硬化的重要病因之一,患者一旦進(jìn)入肝硬化代償期即意味著其肝臟功能明顯減退,死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著升高,5年存活率可降至50.0%左右[11]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,2015年全球共有約7 100萬(wàn)人被確診為HCV感染,其中30.0%以上進(jìn)展為肝硬化或肝癌,同時(shí)每年約39.9萬(wàn)人死于丙型肝炎及其所引發(fā)的肝硬化等疾病[12]。早期評(píng)估肝炎患者肝臟損傷情況對(duì)疾病治療和預(yù)后改善均具有重要意義。超聲引導(dǎo)下的肝臟穿刺活檢是判斷患者肝臟炎癥分級(jí)和纖維化分期的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但該技術(shù)屬于有創(chuàng)操作,且檢測(cè)工序煩瑣、周期長(zhǎng)。近年來,隨著血清學(xué)指標(biāo)研究的深入,其在疾病診斷、病情和臨床效果評(píng)估中的優(yōu)勢(shì)越來越明顯,受到臨床工作者的廣泛關(guān)注。

HCV屬于單股正鏈RNA病毒,HCV感染者HCV-DNA水平可在一程度上反映疾病進(jìn)展?fàn)顩r和宿住免疫狀態(tài),其水平越高提示病毒復(fù)制能力越強(qiáng),機(jī)體循環(huán)病毒量越大,免疫機(jī)制清除病毒難度越大[13];同時(shí),HCV大量復(fù)制會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)合成,改變?nèi)苊阁w膜通透性,增加肝細(xì)胞毒性損傷[14]。HCV-Ab是HCV感染后刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)所釋放的蛋白分子,其在HCV感染和病毒性肝炎診斷中具有良好的靈敏度和特異度[15]。本研究結(jié)果顯示,觀察組HCV-Ab滴度與HCV-DNA載量呈正相關(guān),且隨著患者肝臟組織炎癥分級(jí)增加,纖維化程度加重,血清HCV-Ab滴度顯著升高(P<0.05),對(duì)患者肝硬化發(fā)生具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值(P<0.05)。這可能歸因于HCV持續(xù)復(fù)制不斷刺激人體免疫細(xì)胞為對(duì)抗病毒而釋放相應(yīng)抗體,同時(shí)病毒復(fù)制導(dǎo)致局部炎癥反復(fù)遷延,肝細(xì)胞持續(xù)壞死,纖維組織過度增生,最終導(dǎo)致了肝硬化的發(fā)生[16]。

miRNA是一類可在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的小分子RNA,同時(shí)可參與病毒感染性疾病及惡性腫瘤等發(fā)生、發(fā)展過程。相關(guān)研究證實(shí),miRNA與肝炎病毒所致肝臟損傷過程密切相關(guān)[17]。miR-27a是位于19號(hào)染色體上的小分子RNA,其高表達(dá)與病毒侵襲、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等病理過程有關(guān)[18];miR-130a是一種與血小板功能和惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的小分子RNA。研究顯示,miR-27a是乙型肝炎患者肝硬化發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一,且可預(yù)測(cè)乙型肝炎肝硬化的發(fā)生,但預(yù)測(cè)靈敏度和特異度僅分別為73.02%和61.19%,而與另外一種微小RNA分子聯(lián)合檢測(cè)能有效提高預(yù)測(cè)特異度[7];miR-130a同樣高表達(dá)于乙型肝炎肝硬化患者體內(nèi)[19]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,觀察組血清miR-27a和miR-130a均明顯表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)水平與HCV-DNA載量呈正相關(guān),同時(shí)其表達(dá)水平隨著丙型感染患者肝臟組織炎癥分級(jí)增大、纖維化程度加重而顯著升高(P<0.05)。分析原因,miR-27a一方面有助于HCV侵襲復(fù)制,促進(jìn)局部炎癥反應(yīng),加重肝臟損傷[18];另一方面,可通過抑制肝細(xì)胞增殖蛋白-跨膜泛素樣蛋白1,抑制肝細(xì)胞增殖及肝臟損傷的修復(fù)過程[7]。HCV對(duì)骨髓細(xì)胞具有明顯抑制作用,導(dǎo)致患者體內(nèi)血小板顯著減少;同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)大量形成是肝臟纖維化的中心環(huán)節(jié)。miR-130a可作用于過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ的3’非翻譯區(qū),下調(diào)PPARγ表達(dá),調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ,一方面抑制血小板形成,加速肝臟纖維化;另一方面激活細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá),加速肝臟纖維化進(jìn)程及肝硬化發(fā)生[19-20]。此外,本研究結(jié)果顯示,miR-27a、miR-130a與HCV-Ab滴度聯(lián)合檢測(cè)對(duì)丙型肝炎患者發(fā)生肝硬化具有較高預(yù)測(cè)效能,提示臨床可通過檢測(cè)miR-27a、miR-130a水平與HCV-Ab滴度變化,判斷丙型肝炎患者肝臟損傷進(jìn)程,從而指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述,丙型肝炎患者血清中存在與乙型肝炎相似的miR-27a、miR-130a表達(dá)狀態(tài),且丙型肝炎患者血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平均與機(jī)體HCV-DNA載量、肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化嚴(yán)重程度呈一定相關(guān)性,對(duì)肝硬化具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值,聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)肝硬化效能更高。