MicroRNA-101對肺塵埃沉著病肺纖維化影響的研究*

黃 健,汪 濤,蘇盈笑,洪 炳△

江西省胸科醫院:1.呼吸與危重癥醫學科;2.麻醉科,江西南昌 330006

肺塵埃沉著病是一種不可逆的職業病,由于患者長期吸入大量游離的二氧化硅(SiO2)粉塵導致肺部出現廣泛結節性纖維化病變[1]。數據顯示,我國至今肺塵埃沉著病患者累計超70萬人[2]。肺塵埃沉著病患者的預后情況都較差,因此找尋新的治療方向成為當今的研究熱點。研究顯示,microRNA(miRNA)可通過調控相關的信號通路,參與到纖維化的過程中[3],本研究在此基礎上,進行細胞實驗,通過觀察相關指標水平在不同對照實驗組的變化,研究miRNA-101(miR-101)在延緩肺塵埃沉著病肺纖維化中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級健康成年雄性C57BL/6小鼠18只,2月齡,體質量20～25 g,購自南昌大學醫學院動物中心。

1.2儀器與試劑 Olympus光學顯微鏡(Olympus 公司),Forma 311CO2細胞培養箱、ECO0.9超凈工作臺、Siemens低溫-80 ℃冰柜、低溫離心機(美國Thermo公司),4 ℃冰箱及-20 ℃冰箱(德國Siemens公司)、DYY-7C Western電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、SPL-250電熱恒溫水浴鍋(北京泰瑞有限公司);兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)抗體(GeneTex公司),羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體(碧云天生物技術公司),RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(上海貝博生物公司);SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(莊盟生物公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京百萊公司),SiO2粉塵(Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1肺塵埃沉著病小鼠的構建 將18只雄性C57BL/6小鼠均分為空白對照組、生理鹽水組及SiO2組,各組小鼠稱體質量后,用75%乙醇消毒,鈍性分離皮膚,逐層暴露氣管。生理鹽水組、SiO2組分別使用微量注射器吸取50 μL生理鹽水或SiO2粉塵混懸液后,經兩氣管軟骨環間隙朝向心端刺入氣管,空白對照組小鼠只做假手術處理。待動物清醒后,常規飼養。

1.3.2小鼠肺組織形態 各組小鼠處死后留取肺組織,取部分肺組織采用4%的多聚甲醛固定24 h,經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟后,以5 ?m厚度連續切片,HE染色后,采用光學顯微鏡觀察各組小鼠肺組織形態。

1.3.3小鼠肺組織miR-101表達水平檢測 小鼠處死后留取肺組織,通過實時定量PCR檢測各組小鼠肺組織中miR-101的表達水平。

1.3.4小鼠肺組織Col I表達水平檢測 采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑預混液裂解細胞,將上清液置于-80 ℃保存,采用蛋白質印跡法對蛋白質進行定量檢測,各組細胞的蛋白樣品通過SDS-PSGE凝膠電泳進行分離。PVDF 膜恒流200 mA進行轉模,轉膜結束用考馬斯亮藍染色液觀察凝膠中蛋白轉移情況。用麗春紅染色液對PVDF膜進行染色,膜上有粉紅色條帶表明蛋白轉移成功。使用TBST緩沖液漂洗干凈,進行免疫檢測,5%脫脂奶粉封閉膜,4 ℃過夜。按照兔抗鼠一抗說明書配制好反應液,孵育2 h。TBST 緩沖液漂洗3次,按照羊抗兔二抗說明書配制好二抗反應液,孵育2 h。TBST緩沖液洗膜3次,顯色后上機采圖。應用ImageLab醫學圖像分析軟件對蛋白質印跡所表達的條帶進行半定量檢測,用平均光密度(A)表示。框取各泳道蛋白,對照彩色Marker分層及相應的分子量標記,測出A,目的蛋白A/大鼠β肌動蛋白(β-actin)A。

1.4檢測指標 (1)比較各組小鼠肺組織形態學變化;(2)比較各組小鼠肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達水平。

2 結 果

2.1肺塵埃沉著病小鼠的構建情況 SiO2組在28 d形成肺塵埃沉著病模型。空白對照組及生理鹽水組小鼠肺組織結構完整,肺泡間隔均勻,無間質纖維組織增生。SiO2組小鼠肺部組織發生纖維化,肺部結構被破壞,肺間質和肺泡內有大量的細胞浸潤,并且伴有炎癥反應,血管壁增厚。

2.2肺塵埃沉著病小鼠肺組織形態學改變 空白對照組及生理鹽水組肺泡結構正常,肺泡壁薄;SiO2組肺泡間隔增寬,肺泡壁增厚,結構塌陷,纖維細胞和肉芽腫明顯,炎癥細胞大量浸潤,肺間質實變充血,殘存少量正常肺泡。見圖1。

注:A為空白對照組;B為生理鹽水組;C為SiO2組。

2.3三組小鼠肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達水平比較 生理鹽水組肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達水平與空白對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。SiO2組的miR-101表達水平低于空白對照組,而ColⅠ蛋白水平高于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組肺塵埃沉著病小鼠肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達水平比較

3 討 論

肺塵埃沉著病是我國目前危害最嚴重和造成嚴重社會影響的職業病。肺塵埃沉著病的肺纖維化涉及大量細胞因子及細胞因子形成的復雜網絡系統。近年來發現miRNA可以靶向作用于相關的信號傳導通路[4-5],對組織纖維化的發生、發展起到重要作用。國外研究表明miR-101在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中表達下調,可抑制成纖維細胞活化[6-8]。目前已知肺塵埃沉著病的病理改變包括結節、彌漫性纖維化、塵斑,但肺纖維化發病機制較為復雜尚未完全明確[9-12]。肺纖維化是由于各類刺激導致的肺泡上皮細胞損傷,進一步與成纖維細胞作用,在肺損傷區域出現肺成纖維細胞細胞累積,肺成纖維細胞灶從而形成[13]。

SiO2進入肺組織后,能夠激活細胞自噬,進而釋放大量炎癥細胞因子,造成持續性循環信號錯誤傳導,導致級聯放大效應,造成不可逆的肺組織損傷,致使患者生存質量下降。HE染色后觀察各組小鼠肺組織形態學改變發現,空白對照組及生理鹽水對照組肺泡結構正常,肺泡壁薄;SiO2模型組肺泡間隔增寬,肺泡壁增厚,結構塌陷,纖維細胞和肉芽腫明顯,炎癥細胞大量浸潤,肺間質實變充血,殘存少量正常肺泡,提示SiO2干預后肺組織損傷嚴重。

miRNA是一類內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,可對基因表達進行調控。miR-101過表達可以減輕心肌梗死后心肌纖維化,也可作為其他器官纖維化疾病潛在治療靶點。本研究結果表明,SiO2組的miR-101表達水平低于空白對照組(P<0.05),提示miR-101是一種負性調控因子,在肺塵埃沉著病纖維化中發揮了同樣的作用。本研究結果顯示,空白對照組與生理鹽水對照組小鼠肺組織的miR-101和Col I表達水平比較,差異無統計學差異(P>0.05),而SiO2組的miR-101表達水平顯著降低,Col I蛋白水平則顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05),表明SiO2粉塵能夠激活肺纖維化細胞,使ColⅠ蛋白表達水平明顯升高,提示有大量成纖維細胞發生了轉化,而miR-101可改善SiO2粉塵誘導的肺纖維化。既往研究表明,miR-101是一種抗纖維化的microRNA[14],與本研究結果一致。

綜上所述,miR-101的特異性表達抑制了肺纖維化的發病過程,調控miR-101可作為肺纖維化治療的有效方法,為肺纖維化的臨床診斷和治療提供新的依據和方向。