miRNA-146通過調控TLR4/NF-κB信號通路促進POI模型卵巢顆粒細胞生長的機制研究*

劉 英,何鳳屏,△,劉玉蘭,范舒舒,劉彥慧

1.廣東省韶關市粵北人民醫院體檢中心,廣東韶關 523125;2.廣東省東莞市婦幼保健院/東莞市生殖與遺傳研究所,廣東東莞 512026

原發性卵巢功能不全(POI)通常是指女性40歲之前閉經,伴有高卵泡刺激素(FSH)和低雌激素水平,卵巢功能喪失導致閉經和性器官萎縮,抑制卵泡生長和發育[1]。目前尚無特異性標志物預測POI的發生,也無有效治療措施改善卵巢功能,是導致女性不孕的重要原因[1-2]。POI病因不清楚,其發病機制十分復雜,迄今為止尚不明確。文獻顯示,白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等炎癥因子所介導的生理性炎癥反應參與卵泡發育、成熟及排卵過程,炎癥因子異常表達引發病理性炎癥反應,可導致影響卵泡質量和排卵障礙及不孕等事件的發生[3]。卵巢中卵泡的正常發育、成熟及排出是女性孕育的重要條件,從始基卵泡發育至排卵前卵泡的過程中大量相關炎癥因子活躍存在,但是任何影響卵母細胞質量及卵泡發育、成熟及排出過程的因素,均可能引起卵泡質量、排卵障礙進而導致女性不孕。據世界衛生組織(WHO)統計,20.0%～40.0%的不孕女性存在排卵障礙和卵泡發育不良,均與慢性炎癥有關[4],慢性炎癥反應引起的卵泡發育不良和排卵障礙性等常見于POI、多囊卵巢綜合征(PCOS)等疾病,長期的慢性炎癥還可引起炎癥性衰老[5-6],嚴重影響患者生育力。

微小RNA(miRNA)是一類新的非編碼RNA,它通過與靶mRNA特異性結合,降解靶向mRNA或抑制其翻譯過程,從而參與疾病的發生和發展,是重要的基因調控分子。既往研究表明,miRNAs在卵巢和生殖細胞中均有表達[7]。miRNA-146是第一個被發現對免疫系統有調節作用的miRNA,miRNA-146可通過負反饋調節核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路減輕或抑制炎癥反應[8]。以往的研究證實miRNA-146通過調控Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號通路抑制脂多糖(LPS)誘導卵巢顆粒細胞凋亡[9]。因此,本研究擬探討miRNA-146促進卵巢顆粒細胞增殖和生長的作用,分析其是否對TLR4/NF-κB信號通路、TNF-α和IL-6炎癥因子有調控作用,為miRNA-146在POI中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雌性BALB/c小鼠(8周;體質量18～22 g)40只,購自中山大學動物實驗室。小鼠在溫度為(22±2)℃、濕度為(50±5)%條件下,光照12 h,黑暗12 h,適應性喂養1周,然后將其隨機分為POI組和對照組,每組20只。動物實驗獲得中山大學動物實驗倫理委員會批準(編號:SYSU-IACUC-020-B1236)。

1.2方法

1.2.1小鼠POI模型的建立 參考文獻[10]通過注射透明帶3肽(pZP3)建立POI小鼠模型,模型建立由中山大學動物室進行并提供POI模型鼠。

1.2.2miRNA-146水平檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miRNA-146水平,采用Trizol法提取血清中總RNA,采用Roche LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀反轉錄為cDNA,進行PCR擴增反應,內參基因U6,嚴格按說明書進行操作。miRNA-146、內參U6引物和探針由廣州市銳博生物有限公司提供。 miRNA-146a正向引物:5′-CACACAACGTCTCCGCTAT-3′,反向引物:5′-GTGCGATCCAGTCGCG-3′;U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6反向引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL,正向引物 0.4 μL,反向引物 0.4 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,DNA模板2.0 μL,去離子水6.8 μL。反應條件:95 ℃ 10 s,循環1次;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環40次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.2.3小鼠卵巢顆粒細胞培養 每只小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素8～10 U,48 h后,頸椎脫臼處死,無菌條件下迅速取出雙側卵巢,用緩沖液PBS清洗3次,在體視顯微鏡下去除其周圍脂肪和被膜,用1 mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞和卵母細胞釋放出來,加入1 g/L透明質酸酶消化使顆粒細胞與卵母細胞分離,用孔徑為0.074 mm篩網過濾,1 000 r/min離心5 min。棄上清液,用PBS(-)清洗3次,加入基礎培養液(D/F12培養基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+0.5μg/mL兩性霉素2B+體積分數10%FBS)重懸。倒置相差顯微鏡觀察結果表明,剛接種時顆粒細胞呈球形,10 h后貼壁生長,培養24 h后,形態不規則,呈多角形或梭形。培養5 d時可鋪滿皿底,形成單層的顆粒細胞。

1.2.4雙側卵巢相對質量測定及組織形態學觀察 常規無菌方法留取卵巢,用冰冷生理鹽水清潔,濾紙干燥,然后稱重,計算小鼠卵巢相對質量[卵巢質量(mg)÷體質量(g)]。

卵巢稱重后用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,將蠟塊切成4 μm厚的薄片,脫蠟,蘇木精-伊紅染色。每只切片至少選3個不同區域,高倍鏡(×200)下觀察卵巢組織結構。

1.2.5卵巢顆粒細胞生長的活力測定 采用MTT比色法測定顆粒細胞生長的活力。miRNA-146轉染顆粒細胞接種于密度為1×103個細胞/孔的6孔板中,用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗2次后,10 μL MTT溶液稀釋為5 mg/mL,加到每一孔中。將培養皿在37 ℃條件下培養10 min,然后添加150 μL的二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(A)。

1.2.6卵巢顆粒細胞增殖和凋亡測定 (1)顆粒細胞增殖:采用細胞克隆實驗評價顆粒細胞的增殖能力。取對數生長期的細胞,用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打為單個細胞,離心后計數,取需要的細胞量(200～500個/孔)重懸于對應的培養基,接種于細胞培養皿里。于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱內培養2～3周,在顯微鏡下觀察細胞克隆的情況。(2)顆粒細胞凋亡:使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京Biosea生物技術有限公司)進行顆粒細胞凋亡檢測,鑒定和定量顆粒凋亡細胞。將miRNA轉染的細胞接種在密度為1×105個細胞/孔的6孔板中,用冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌處理細胞2次,并將其重新懸浮在含有10 μL膜聯蛋白V和5 μL PI的200 μL結合緩沖液中。將貼壁細胞和漂浮細胞結合,按照說明書進行操作,使用流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特)測量細胞百分比,以區分凋亡細胞(膜聯蛋白V陽性和PI陰性)和壞死細胞(膜聯蛋白V陰性和PI陽性)。

1.2.7miRNA-146轉染 VSMC消化離心后以合適密度接種到培養板,24 h后細胞融合到60%～70%時按照Lipofec-tamine 2000轉染試劑說明書進行操作,分成miRNA-146抑制劑組、miRNA-146模擬物組及對照組,分別轉染miRNA-146抑制劑(50 mmol/L)、miRNA-146模擬物(50 mmol/L),對照組加入同等劑量Lipofec-tamine 2000轉染試劑及PBS,5 h后換成完全培養基,通過熒光顯微鏡觀察轉染效率。通過克隆實驗檢測miR-146模擬物、抑制物轉染后顆粒細胞增殖情況,克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.2.8蛋白質印跡法及其他實驗方法 采用蛋白質印跡法檢測小鼠卵巢組織中TLR4和NF-κB蛋白的水平,TLR4和NF-κB抗體購自Abcam公司。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(廣州市銳博生物有限公司)檢測血清IL-6和TNF-α的水平。采用Cobas 601化學發光儀檢測血清FSH和雌激素(E2)水平。

2 結 果

2.1兩組小鼠性激素水平比較 POI組的FSH水平高于對照組,而E2水平低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠性激素水平比較

2.2兩組小鼠血清miRNA-146、IL-6、TNF-α水平比較 POI組血清miRNA-146水平低于對照組,IL-6、TNF-α水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠miRNA-146、IL-6、TNF-α水平比較

2.3miRNA-146對卵巢顆粒細胞增殖、活力、生長、凋亡的影響 miRNA-146模擬物增加顆粒細胞的克隆形成,miRNA-146抑制劑抑制顆粒細胞的克隆形成,見圖1A。miRNA-146模擬物在顆粒細胞中呈高水平表達,見圖1B;在不同水平(5,10,20,40 μg/mL)miRNA-146的作用下,顆粒細胞生長活力均增強,且呈濃度依賴趨勢,見圖1C。miRNA-146轉染后,miRNA-146模擬物組細胞凋亡率低于對照組,miRNA-146抑制劑組細胞凋亡率高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.01),見圖1D。

注:A為miR-146模擬物、抑制劑轉染后顆粒細胞增殖情況;B為miR-146模擬物、抑制物轉染后miRNA-146表達水平;C為不同濃度miRNA-146對增加顆粒細胞生長活性的影響;D為各組顆粒細胞凋亡的情況。

2.4兩組小鼠卵巢組織中TLR4、NF-κB蛋白的水平比較 miRNA-146模擬物組的TLR4、NF-κB水平低于對照組,而miRNA-146抑制劑組的TLR4、NF-κB水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.5相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示,POI小鼠的miRNA-146水平與TLR4水平和NF-κB水平呈負相關(r=-0.725、-0.681,P<0.05)。

2.6兩組小鼠POI模型的卵巢形態學和組織學變化 POI組小鼠的卵巢最大徑及質量明顯小于對照組(P<0.01)。見表3。POI組小鼠卵巢組織中可見早期卵泡閉鎖及退化的卵母細胞和顆粒細胞,伴有大量間質和纖維組織增生,而對照組鼠卵巢組織學可見大量的成熟卵泡。見圖2。

注:A為對照組;B為POI組。

表3 兩組卵巢最大徑及質量比較

3 討 論

POI可能與炎癥反應有顯著相關性,而卵巢早衰(POF)為POI發展的終末階段。慢性低度炎癥為POI發生的重要原因之一,UC-MSC移植可通過旁分泌機制發揮抗凋亡和抗炎癥反應作用,抑制IL-6 和IL-1β水平,減輕化療誘導的POI或POF,改善卵巢功能,提示炎癥反應的降低可能與POF的改善有相關性,同時也有研究通過臨床患者試驗證實炎癥因子可能作為POI或POF患者的獨立生物標志物[11]。根據當前的研究結果筆者推測POF與炎癥反應有關。本研究結果顯示POI組小鼠的炎癥因子TNF-α和IL-6水平高于對照組,主要作用機制可能是miRNA-146負性調控TLR4/NF-κB信號通路,誘導TNF-α和IL-6高水平表達,導致卵巢發生炎癥反應、缺氧,影響卵泡質量,最終造成不孕癥的發生。POI是一個逐階遞進的過程,在POI的早期,如果調控miRNA-146、TLR4/NF-κB、TNF-α和IL-6水平,可以維持性激素水平在正常范圍,不會影響生育能力,提示miRNA-146、TLR4、NF-κB水平與POI模型病情程度密切相關,可發揮臨床預警作用。本研究結果顯示,POI組血清miRNA-146、E2水平低于對照組,而FSH水平高于對照組,可能是miRNA-146水平下調促進患者雌激素水平的異常,從而影響卵巢功能和卵泡質量[12]。一項在模型體內注射miRNA-146模擬物的研究顯示,E2水平顯著上調,FSH、LPS水平顯著下調[13]。因此,miRNA-146有望作為評估卵泡質量的指標之一。

miRNAs與特異性的靶基因結合,在轉錄后水平引起靶mRNA剪切和翻譯的抑制,參與調控細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應、腫瘤的發生等[14],miRNA-146家族成員被稱為炎癥誘導型miRNAs,參與Toll樣受體(TLRs)信號的負反饋調節,誘導炎癥反應,參與動脈粥樣硬化、心血管疾病的發生和發展有密切關聯[15]。TLRs是一種模式識別受體,參與慢性炎癥、氧化應激、腫瘤微環境的形成。TLRs識別相應配體后,通過活化一系列信號轉導分子激活NF-κB通路,介導炎癥反應和氧化應激損傷等免疫反應[8-9]。TLRs存在于卵巢和生殖道中,它們在卵巢和卵泡排卵活動中發揮重要作用。NF-κB、有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(JAK/STAT)是炎癥因子信號轉導介導炎癥反應的主要通路[16-17],即使作用途徑不同,但其中阻礙卵泡發育及排卵過程的相關炎癥因子所起的作用是一樣的。本研究結果顯示,miRNA-146模擬物能夠提高顆粒細胞增殖和生長的活力,并減少顆粒細胞的凋亡率,而且miRNA-146水平與顆粒細胞生長呈依賴關系,提示miRNA-146具有促進顆粒細胞增殖和生長的作用。其機制可能是miRNA-146通過調控免疫反應影響HPO軸的神經內分泌活動,誘導雌激素釋放,從而促進顆粒細胞增殖和生長。有研究表明,炎癥因子IL-6、免疫細胞與NF-κB等信號通路具有相互調控作用,通過影響垂體促性腺激素FSH受體、LH受體表達及卵巢中雌、孕激素的水平以促進卵泡發育,而垂體FSH及LH的合成與分泌受到下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)的調節,誘導雌激素、孕激素釋放,促進卵泡發育和成熟,但其確切機制尚未明確[16-18]。

本研究結果顯示,POI組miRNA-146水平低于對照組,miRNA-146模擬物組的TLR4、NF-κB水平低于對照組,而miRNA-146抑制劑組的TLR4、NF-κB表達水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),可能是上調miRNA-146通過調控TLR4/NF-κB信號通路影響TNF-α和IL-6的表達,提示炎癥因子TNF-α和IL-6參與卵巢的炎癥反應,從而影響卵巢功能的障礙,是一種炎癥性的卵巢功能衰竭。本研究結果顯示,miRNA-146抑制物誘導小鼠TLR4、NF-κB表達水平顯著升高,而miR-146模擬物誘導TLR4和NF-κB表達水平顯著降低,提示TLR4可能是miRNA-146的靶基因,并且通過TLR4/NF-κB信號通路對POI發揮調控作用,其機制可能與下游的炎癥因子釋放有關。

本研究通過HE染色證實了在POI過程中,出現了卵巢體積和質量均減少,原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡等顯著降低,閉鎖卵泡增加。miRNA-146過表達通過抑制Dab2ip/Ask1/p38MAPK通路和γH2A.X磷酸化減輕小鼠參與卵細胞的增殖與凋亡過程[19],同時有研究表明POF與顆粒細胞凋亡和卵泡早期閉鎖密切相關,卵泡顆粒細胞發生凋亡是卵泡早期閉鎖的主要原因,這是一個不可逆的逐步損耗過程,卵泡細胞缺乏再生能力,導致女性生殖能力的衰退,在早期閉鎖卵泡的顆粒細胞中Bax 促凋亡蛋白大量表達,而在正常或完全閉鎖卵泡中幾乎不表達;Bcl-2 基因缺失的小鼠模型中,卵泡數量下降,高表達的Bcl-2 基因抑制小鼠卵泡顆粒細胞凋亡和卵泡早期閉鎖,表明了在卵泡發育過程中Bcl-2 和Bax基因分別參與卵細胞增殖和凋亡的調控[20],提示miRNA-146是卵巢正常功能的重要調控分子,發揮抑制POI的作用。

綜上所述,本研究證明了POI與炎癥反應有關,是一種由miRNA調控的卵巢慢性炎癥性功能衰退,即miRNA-146可能過TLR4/NF-κB信號通路抑制炎癥反應,促進卵巢顆粒細胞增殖和生長,對POI的卵巢功能發揮保護作用。本實驗通過相關性分析確定miRNA-146與TLR4/NF-κB信號通路負相關,為miRNA-146在臨床的應用提供理論基礎。