孤兒核受體NR4A1通過NF-κB/COX-2對氧化應激誘導的血栓形成的保護作用及機制研究*

鐘華平,李 林,謝家和

贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院:1.心臟ICU;2.血液科;3.心內科,江西贛州 341000

血栓性疾病近年來因其發(fā)病率高居各大疾病之首而受到重視,已成為全球疾病負擔和人口死亡的重要原因,嚴重威脅人類健康[1]。孤兒核受體NR4A1是一種即刻早期基因,參與體內多個病理生理過程。NR4A1可通過影響血栓調節(jié)蛋白及ET-1的表達抑制血栓形成[2]。然而,仍不能完全解釋NR4A1參與調節(jié)血栓形成的確切機制。核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路是經典的炎癥信號通路,有研究報道利伐沙班等藥物通過NF-κB進而抑制血栓形成[3],但其是否參與由NR4A1調控的血栓形成,國內外相關研究較少見。目前血栓形成病因較多,其中氧化應激是重要的病因之一。本研究擬研究NR4A1對氧化應激誘導的血栓形成的保護作用及其是否通過調節(jié)NF-κB/環(huán)氧合酶-2(COX-2)信號軸從而調節(jié)血栓形成經典下游分子NO/內皮素-1(ET-1)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、血栓素(TX)A2/前列環(huán)素(PGI2)的表達。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取健康SD大鼠30只,雌雄各半,每只體質量200～240 g。適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、模型組和NR4A1組,每組10只。本實驗通過贛南醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準,審批號:2022109。

1.2試劑與儀器 殼囊孢菌素B(Csn-B)、3%戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛(美國Sigma公司);PBS緩沖液(HyClone公司); 無水三氯化鐵(FeCl3)試劑(阿拉丁試劑有限公司);硝酸還原酶試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);放射免疫分析試劑盒(北京科美生物技術有限公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(大連TaKaRa公司);電子分析天平(美國Thermo公司);病理切片掃描儀(Hamamatsu公司)。

1.3方法

1.3.1頸動脈血栓模型制備 NR4A1組大鼠灌胃給予10 mg/kg PBS溶解的Csn-B,對照組、模型組大鼠灌胃給予等量PBS。給藥1周后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉大鼠,取仰臥位固定,分離兩側頸總動脈,右側頸總動脈備采血用,分離左側頸總動脈長度3 cm,下置小片塑料薄膜(4 cm×2 cm),保護血管周圍組織。模型組、NR4A1組用完全浸透50% FeCl3溶液的濾紙條(2 cm×1 cm)環(huán)敷于左側頸總動脈段上,對照組敷生理鹽水濾紙條,30 min后去除濾紙條,去除濾紙條后30 min,從右側頸總動脈插管取血4 mL,4 ℃ 3 000 r/min離心15 min,分離血清,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2測定血栓重量 取血后迅速剪下左側頸總動脈血栓部位血管段,用濾紙吸干表面血液,用電子分析天平稱取血栓濕重。

1.3.3觀察病理情況 左側頸總動脈血栓部位血管段稱重后,浸泡于4%多聚甲醛中固定,用于蘇木精-伊紅(HE)染色,并使用病理切片掃描儀對切片進行掃描。

1.3.4測定血清部分指標水平 采用硝酸還原酶法檢測NO水平,ELISA法檢測ET-1、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、PAI-1的水平,用放射免疫分析法測定TXA2、前列環(huán)素(PGI2)的穩(wěn)定代謝產物TXB2、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)水平。以上檢測均按照試劑盒使用說明書進行操作。

1.3.5測定大鼠頸動脈組織蛋白表達水平 取大鼠左側頸動脈組織剪碎,加入RIPA蛋白裂解液,提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,得出樣品總濃度后進行上樣、電泳、轉膜、封閉。加入Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化蛋白抗原(MyD88)、NF-κB一抗(稀釋濃度均為 1∶1 000)4 ℃孵育過夜;清洗,加入二抗(稀釋濃度1∶3 000)孵育。按照電化學發(fā)光試劑盒說明書進行顯色,采用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像測定條帶灰度值,以GAPDH為內參蛋白,計算NR4A1、NF-κB、COX-2蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠血栓重量比較 對照組未形成血栓[(0.00±0.00)mg],NR4A1組大鼠血栓重量為(4.96±1.42)mg,明顯低于模型組的(8.74±2.36)mg,差異有統(tǒng)計學意義(F=75.875,P<0.05)。

2.2各組大鼠頸動脈病理情況 對照組血管結構完整,內皮細胞未見增生或脫落,管腔內無明顯血栓形成,管壁均勻。而模型組血管管腔內存在大面積的連續(xù)血栓,幾乎完全阻斷血管,鏡下見血管壁變薄,結構不清晰。與模型組相比,NR4A1組血栓形成明顯減少,鏡下見血管壁各層結構較模型組清晰。

2.3各組大鼠頸動脈組織NR4A1、p-NF-κB p65、COX-2蛋白表達水平比較 模型組與NR4A1組大鼠頸動脈組織NR4A1蛋白表達水平均低于對照組(P<0.05),且模型組低于NR4A1組(P<0.05);模型組與NR4A1組大鼠頸動脈組織p-NF-κB p65、COX-2蛋白表達水平均高于對照組(P<0.05),且模型組均高于NR4A1組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠頸動脈組織蛋白表達水平比較

2.4各組大鼠血清部分指標水平比較 模型組、NR4A1組大鼠血清NO、eNOS、6-keto-PGF1α水平及NO/ET-1均低于對照組(P<0.05),且模型組均低于NR4A1組(P<0.05);模型組、NR4A1組大鼠血清ET-1、PAI-1、TXB2水平及TXB2/6-keto-PGF1α均高于對照組(P<0.05),且模型組高于NR4A1組(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠頸動脈組織蛋白印跡圖

表2 各組大鼠血清部分指標水平比較

3 討 論

血栓形成可引起血栓栓塞性疾病,其致死率、致殘率較高,而且發(fā)病率逐年增加,對人類健康造成極大損害。故尋找抗血栓治療的潛在靶點具有重要意義。本研究用FeCl3構建頸動脈血栓大鼠模型,通過腹腔注射NR4A1激動劑促進大鼠NR4A1的表達,同時檢測NF-κB/COX-2信號軸相關蛋白表達水平及NO/ET-1、PAI-1、TXA2/PGI2的表達,以期分析NR4A1對氧化應激誘導的血栓形成的保護作用機制。

NR4A1廣泛表達于各組織、器官。相關研究顯示,NR4A1主要參與細胞存活、凋亡、代謝、血管重塑和膽固醇合成等過程,具有調節(jié)葡萄糖代謝,調控血管新生,調節(jié)內皮細胞功能等作用[4-6]。NF-κB作為炎癥的關鍵轉錄因子,其激活可調節(jié)下游炎癥介質COX-2水平。COX-2為誘導型環(huán)氧化酶,在生理狀態(tài)下不表達或低水平表達,出現(xiàn)炎癥時其表達上調,通過催化產物前列腺素、TX、細胞間黏附分子等炎癥介質參與血栓形成[7]。本研究結果顯示,NR4A1組大鼠血栓重量明顯低于模型組(P<0.05);模型組大鼠頸動脈組織NR4A1蛋白表達水平低于NR4A1組(P<0.05);模型組大鼠頸動脈組織p-NF-κB p65及COX-2蛋白均高于NR4A1組(P<0.05)。提示上調NR4A1水平,可抑制NF-κB/COX-2信號通路,進而改善頸動脈血栓大鼠模型中血栓情況。有研究發(fā)現(xiàn),抑制NF-κB信號通路,可減輕大鼠深靜脈血栓模型中的血栓和炎癥[8],與本研究結果一致。

NO和ET-1均為血管內皮細胞合成、釋放的血管活性因子,可反映血管內皮功能。NO/ET-1 比值的調節(jié)對血栓形成起著重要作用。eNOS可通過釋放NO來調節(jié)正常的血管張力及血栓阻力,維持內皮細胞的穩(wěn)態(tài)。當血管內皮損傷時,會導致氧自由基生成增加,NO分泌減少。PGI2具有舒張血管,抑制血小板活化,抗血栓形成的作用,6-keto-PGF1α可反映PGI2的水平;TXA2具有強烈的促使血管收縮及活化血小板、促進血栓形成的作用,TXB2可反映TXA2的水平;PGI2和TXA2平衡失調與血栓形成密切相關[9]。PAI-1在纖溶系統(tǒng)中起著決定性作用,能夠調節(jié)纖維蛋白溶解的過程,進而促進血栓形成并抑制血栓的降解和重塑[10]。本研究中,模型組、NR4A1組大鼠血清NO、eNOS、6-keto-PGF1α水平及NO/ET-1均低于對照組(P<0.05),且模型組均低于NR4A1組(P<0.05);模型組、NR4A1組大鼠血清ET-1、PAI-1、TXB2水平及TXB2/6-keto-PGF1α均高于對照組(P<0.05),且模型組均高于NR4A1組(P<0.05)。提示NR4A1可上調NO、eNOS、6-keto-PGF1α水平及NO/ET-1,下調ET-1、PAI-1、TXB2水平及TXB2/6-keto-PGF1α,進而減輕大鼠頸動脈血栓模型中的血栓和炎癥。

綜上所述,NR4A1對NF-κB/COX-2信號通路相關蛋白表達具有負向調控作用,進而減輕大鼠深靜脈血栓模型中的血栓和炎癥,為臨床血栓栓塞性疾病的治療提供了新的思路和策略。