MALDI-TOF MS在NTM臨床分離株快速鑒定中的應用研究*

黃琨波,陳桂春,林玉玲,陳清清,李 科,張建明△

福建醫科大學附屬泉州第一醫院:1.檢驗科;2.心內科,福建泉州 362000

非結核分枝桿菌(NTM)病是指人體感染了NTM引起相關組織或臟器的病變。NTM肺病與肺結核有著類似的臨床癥狀和影像特征,二者無法通過痰標本抗酸染色進行區分,常造成誤診[1]。目前可以通過膠體金和熒光PCR檢測等手段初步排除結核菌的感染,但仍無法明確診斷NTM病,更無法區分至亞種,誤診率也較高。滯后的鑒定技術嚴重阻礙了NTM病的診治[2]。由于診斷困難、高度耐藥且容易復發,近年來我國NTM病的發病率明顯上升,對人類健康構成極大的威脅[3]。

NTM傳統培養方法操作繁雜,培養周期長,可重復性差,加之分枝桿菌大多屬于慢生長菌,培養條件較苛刻,不易生長,已無法滿足臨床實際工作的需求[3]。近年來,基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術在臨床微生物鑒定中的應用日漸廣泛。MALDI-TOF MS與傳統方法和分子生物學技術相比,具有快速、準確、靈敏及經濟等優點,盡管不能完全替代傳統培養方法,但也彌補了傳統方法操作復雜、費時等不足[4-5]。MALDI-TOF MS技術在國內用于NTM的鑒別較少見,因此臨床參考數據較為有限[6]。本研究擬通過優化質譜上機前處理條件,建立適用于臨床的NTM MALDI-TOF MS鑒定方法。現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018-2020年泉州某三甲醫院微生物實驗室的部分臨床疑似NTM感染(涂片抗酸染色陽性,分離培養并經結核DNA檢測為陰性,初步鑒為NTM)患者的痰液、肺泡灌洗液、胸部穿刺液和腦脊液等樣本。采用改良羅氏培養基(L-J培養基)進行分離培養。NTM參考株來源于美國菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 主要儀器:全自動快速生物質譜檢測系統(Bruker Daltonik GmbH);基因擴增儀(杭州博日科技有限公司);二氧化碳培養箱(賽默飛世爾科技公司)。 主要試劑:基質液;甲酸水溶液;乙腈水溶液;無水乙醇;固體培養基;哥倫比亞血瓊脂平板;PCR 試劑盒、Ex Taq DNA 聚合酶及標準分子量DNA(Marker)購自TaKaRa 公司。

1.3方法

1.3.1傳統(常規)質譜法

1.3.1.1臨床標本前處理 (1)痰標本:首先將痰樣本轉移至螺口管中,視樣本具體性狀,在生物安全柜內加入1～2倍體積的N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)處理液。旋緊蓋子,在渦旋振蕩器上渦旋振蕩充分混勻,靜置15 min。小心打開蓋子,加入適量磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至總體積約40 mL;3 000×g離心20 min,棄上清液用l mL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,并將重懸液接種至新的培養基上。(2)支氣管灌洗液、腦脊液等無菌體液:直接將樣本離心后取沉淀接種進行培養。

1.3.1.2NTM菌株篩選 將經Bactec MGT960系統培養陽性的分枝桿菌菌液接種于羅氏培養基上,37 ℃持續培養4周,記錄菌落的生長狀態。其中,經結核DNA檢測呈陰性的初步判定為NTM。

1.3.1.3菌株DNA提取 采用煮沸裂解法進行菌株DNA的提取。

1.3.2MALDI-TOF MS改良前處理(甲酸提取法)

1.3.2.1標本處理 (1)在1.5 mL的離心管中先加入300 μL去離子水;轉移分枝桿菌樣本到上述離心管中(避免取到培養基,盡可能轉移1～3份10 μL接種環的菌量。取菌量更直觀的概念:離心管中2 μL水的量代表一小份沉淀,5 μL的量代表合適大小的沉淀);煮沸30 min以滅活分枝桿菌(可使用95 ℃的金屬浴或水浴)。(2)使用移液槍反復吹打混勻,然后渦旋振蕩至少1 min,在離心管中形成懸液。(3)添加900 μL的無水乙醇溶液,然后懸液振蕩至少1 min。(4)離心菌體細胞(離心2 min,13 000 r/min)并吸凈上清液。(5)將第4步重復一次,使用移液槍小心吸取剩下的乙醇,以完全除去乙醇溶液。(6)將10 μL 70%甲酸水溶液加入沉淀物中,通過移液槍反復吹打,然后進行渦旋充分混勻,(7)加入10 μL乙腈,通過移液槍反復吹打混合懸液。(8)離心細菌提取物(離心2 min,13 000 r/min )。

1.3.2.2MALDI-TOF MS測定 參考質譜儀的操作說明進行。

1.3.316S rRNA測序

1.3.3.1PCR擴增 參考文獻[7]合成16S rRNA基因的引物,引物均由上海生工生物有限公司合成。PCR體系50 μL,2xTaq MasterMix 25 μL,DNA模板5 μL,引物(10 pmol/L)各1 μL,ddH2O 18 μL。陽性對照為標準株,陰性對照組為ddH2O。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72℃延伸1 min,第2～4步30個循環,最后72 ℃充分延伸10 min。將配好的體系放置到PCR儀中進行PCR反應。

1.3.3.2PCR序列分析 擴增產物經電泳檢測驗證后,取20 pmol/L擴增產物送往上海生工生物技術有限公司進行純化及測序。將基因序列分析結果與GenBank中分枝桿菌標準序列進行比對,相似度最高的菌種為標本所屬菌種。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分比表示,采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1標本收集基本情況 本研究共收集臨床微生物實驗室初步鑒定為NTM的標本50例,以呼吸內科、感染科、ICU和發熱門診來源的標本較為常見。將已有標本轉種于固體培養基上,以獲取單個菌落用于后續實驗分析。

2.2傳統(常規)質譜方法與甲酸提取法的鑒定結果比較 用傳統(常規)質譜方法共鑒定出4例菌株,檢出率為8.0%(4/50),包括膿腫分枝桿菌3例和鳥分枝桿菌1例。采用甲酸提取法共鑒定出24株菌株,檢出率為48.0%(24/50),鑒定結果見表1。在26株未能鑒定出結果的菌株中,有6株的蛋白指紋圖譜具有良好波譜譜峰。兩種方法檢出率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 甲酸提取法鑒定結果

2.316s rRNA基因測序結果

2.3.116s rRNA基因擴增 將甲酸提取法處理后有鑒定結果的菌株,采用加熱裂解法提取核酸,以16S F、16S R作為引物進行16 s rRNA基因擴增,分2批次擴增,第1次擴增10株,第2次擴增14株,共擴增了24株菌株,凝膠電泳結果表明全部有明亮的目的基因擴增條帶出來,選用Mark分子量大小約為2.0 kb,目的核酸片段分子量約為1.5 kb,電泳條帶1.0～2.0 kb,符合試驗預期。部分凝膠電泳條帶見圖1。

注:1～9為菌株擴增結果(約1 500 bp);10為相對分子質量標準DL 2000;11為陰性對照。

2.3.2測序結果分析 將甲酸提取法處理后有鑒定結果的菌株的擴增產物送上海生物技術公司進行測序,通過GenBank進行Blast比對,結果顯示24株均為NTM,結果與質譜鑒定完全一致,符合率為100.0%,其中胞內分枝桿菌6株,馬賽分枝桿菌3株,膿腫分枝桿菌4株,哥倫比亞分枝桿菌1株,鳥分枝桿菌3株,福特分枝桿菌1株,堪薩斯分枝桿菌2株,擬桿菌分枝桿菌1株,隱藏分枝桿菌1株,產黏液分枝桿菌1株,猿分枝桿菌1株。

3 討 論

NTM毒性弱于結核分枝桿菌,大多是機會性致病菌,感染范圍廣,但臨床普遍耐藥,治療方案存在較大差異。近年來,NTM感染率和發病率逐漸增加,其潛在危害越來越受到重視[3]。全球性的結核病高負擔國家中,我國的情況一直不容樂觀。

臨床患者中發生聯合耐藥的概率在升高,且具有廣泛的耐藥率[8-10]。因此臨床實驗室中快速、準確地鑒定NTM就顯得極為迫切。傳統生化方法可以用于鑒別MTBC和NTM,卻無法避免操作煩瑣、實驗周期長的缺陷,生化培養以細菌生長特點和生化反應為依據作出判斷,本身存在一定的局限性。近年來,分子診斷技術已經得到全面發展,PCR、PCR直接測序法、限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)已成為較常用的鑒定結核分枝桿菌的方法[11]。

有文獻報道PCR-核酸探針技術,能有效鑒別23種臨床常見分枝桿菌;PCR單鏈構象多態性(PCR-SSCP)分析技術、熒光定量PCR(qPCR)技術等,能夠對特定的一種或多種NTM進行快速鑒定,極大地豐富了臨床分枝桿菌鑒定實驗方法;基因芯片技術即cDNA微陣列芯片,能夠對臨床常見20種NTM進行快速鑒定[12]。這些分子生物學技術雖可以快速診斷NTM,但局限于特定的一些分枝桿菌,而且費用高,操作難度較大,對實驗室檢驗人員要求較高,測序引物又因方案不同而變動,引物擴增長度沒有達到一定要求,也很難鑒定出相應菌種,難以做到統一操作,故此,探索新的更為簡便、快速、準確的鑒定方法對臨床工作意義重大。

質譜方法是近年快速發展的一種生物質譜技術,具有極大的潛在價值[13-15]。MALDI-TOF MS技術的基本原理是獲取細菌蛋白質,形成質量圖譜。國內已有MALDI-TOF MS技術應用于細菌分型、耐藥分析的相關文獻報道,充分顯示了其巨大的應用價值。但國內目前MALDI-TOF MS在分枝桿菌鑒定的應用中還未達到預期效果,使NTM在質譜鑒定方面遠落后于細菌。本研究中依照布魯克公司的操作標準,檢出率僅為8.0%(4/50),而采用改良前處理方法(甲酸提取法)后檢出率為48.0%(24/50),差異有統計學意義(P<0.01)。NTM細胞壁中蠟質成分占60%以上,可抵抗機體免疫力和藥物的攻擊,同時能耐受攪拌,不易破碎,因此,傳統方法不易使其細胞壁破碎釋放出蛋白質形成圖譜[16-17]。而采用改良的甲酸提取法后,甲酸能有效地誘導細胞壁破裂,使得細菌緩慢釋放出細胞質中的蛋白,從而提升質譜的鑒定效率[18-19]。本研究表明改良前處理方法后的質譜技術用于NTM 鑒定,與傳統的質譜鑒定方法比較檢出率更高;且與傳統微生物臨床鑒定相比同樣具有質譜本身的經濟、快速等優點。因此,用于鑒別NTM與結核分枝桿菌復合群,一定程度上能夠滿足臨床工作中NTM快速鑒定的需求,對于臨床NTM菌種鑒定有一定的應用價值。

標準數據庫的菌株庫存容量是影響質譜鑒定的一個重要因素[20-21]。本研究中發現,采用甲酸提取法時,在26株未能鑒定出結果的菌株中,有6例菌株質譜鑒定圖譜峰值比較理想,但卻沒有明確結果,分析原因可能是由于本實驗室數據庫不夠全面,沒有對應的標準菌株,從而導致質譜鑒定結果失敗。另一個影響因素就是乙腈溶液和甲酸溶液的稀釋濃度偏低,對蛋白酸化和提取產生影響。除此之外的一個決定性的實驗因素是細菌細胞壁堅實,常規實驗手段難以破壞細菌細胞壁,導致細菌蛋白質獲取困難,甚至蛋白質基本沒有提取出來,以致實驗分析失敗。本研究采用了加熱、加酸、加生物酶等方法,以提高蛋白質含量,不過效果并不理想,因此需要探索破除細菌細胞壁的新方法。

MALDI-TOF MS技術用于NTM鑒定的臨床價值,仍有待于未來大量樣本的研究分析給予更為客觀和科學的評價。本課題在研究過程中,收集標本相對有限,后續研究工作將進一步繼續深入開展下去,以期探索出更加準確、可靠、快速的NTM鑒定技術。綜上所述,MALDI-TOF MS技術用于NTM鑒定及分型,具有實際的應用價值,可用于臨床實驗室檢驗工作。