結核分枝桿菌耐藥基因突變特征及與耐藥水平關系的研究*

蔣燕成,張建明,陳紫萱,張志珊

福建醫科大學附屬泉州第一醫院檢驗科,福建泉州 362000

結核病仍然是世界最致命的傳染病殺手之一。每天約有4 100人死于結核病,有近2.8萬人感染這種可預防且可治愈的疾病。自2000年以來,全球結核病的防治工作已經挽救了約6 600萬人的生命。然而,前幾年新型冠狀病毒感染(COVID-19)大流行使多年來在終止結核病方面取得的進展出現了倒退。2020年,因結核病死亡的人數10年來第一次出現了增加。我國2020年估算的結核病新發患者數為84.2萬(2019年為83.3萬),估算結核病發病率為59/10萬(2019年為58/10萬),在30個結核病高負擔國家中我國估算結核病發病數排第2位(8.5%)[1]。耐多藥結核病(MDR-TB)的出現及持續蔓延,已經成為有效控制結核病的嚴重威脅,因此控制MDR-TB是一個迫切需要關注的問題。MDR-TB的出現和傳播主要是由于DOTS策略實施不當、抗結核藥物短缺或質量差、患者對處方方案治療依從性差[2]。世界衛生組織建議對所有疑似結核病患者進行標準治療前都應進行結核藥敏試驗,以避免獲得性耐藥的進一步產生[3]。本研究對結核分枝桿菌(MTB)的耐藥基因變特征,以及其突變特征與耐藥水平相關性來進行分析,以了解MTB的耐藥機制,盡早盡快地為臨床感染患者治療提供基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月至2021年6月在泉州市第一醫院檢驗科經結核藥敏試驗鑒定為耐利福平、異煙肼的MTB 51株作為研究對象。

1.2儀器與和試劑 Extractor 36 核酸快速提取儀,晶芯?SlideWasherTM洗干儀,晶芯?微陣列芯片掃描儀及MTB耐藥基因檢測試劑盒均購自北京博奧晶典生物科技有限公司。PCR儀和Sensititre?結核藥敏板購自美國賽默飛世爾科技有限公司。MGIT 7 mL培養管、BACTEC MGIT 960系統、MGIT 960SIRE藥敏試劑盒均購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1DNA微陣列芯片法 (1)DNA提取:向核酸提取管中加入50 μL核酸提取液,取混勻的菌液標本(以1個麥氏濁度為宜)20 μL加到核酸提取液中。將核酸提取管置于核酸快速提取儀中,最大轉速振蕩5 min。將核酸提取管置于95 ℃水浴鍋或金屬浴中,加熱5 mim。1 000r/min離心1 min,備用。(2)PCR擴增:根據被測樣品準備200 μL離心管,并預先標記樣品編號。從試劑盒中取出PCR擴增試劑使其充分融化,輕搖混勻。將PCR擴增試劑按每管18 μL分裝于200 μL離心管中,蓋好管蓋。在標本制備區內加入模板DNA。模板DNA包括被測樣品DNA(核酸提取管中的上清液)、陽性對照品或陰性對照品。對于1個樣品,向3管中分別加入同一模板DNA各20 μL。擴增條件設定:37 ℃ 600 s,94 ℃ 600 s,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35個循環;94 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共10個循環;72 ℃ 420 s。(3)芯片雜交:將擴增好的產物置于擴增儀中95 ℃變性5 min,冰浴5 min,取出雜交緩沖液按9 μL雜交緩沖液,相應向每管中分別加入同一樣品的PCR產物1和PCR產物2各3 μL,PCR產物1和PCR產物3各3 μL。在基因微陣列芯片雜交盒的底部加入200 μL蒸餾水。經蓋片的加樣孔加入13.5 μL雜交反應混合物,迅速蓋上雜交盒并密封。立即將密封好的雜交盒水平加入50 ℃預熱的恒溫水浴鍋中,待雜交盒全部放入后計時120 min。雜交反應結束后,將雜交盒水平取出并將芯片取出,再進行芯片的洗滌,洗液Ⅰ洗1次,30 ℃,120 s;洗液Ⅱ洗2次,30 ℃,60 s。然后離心機中離心5 min,甩干。打開TBMDRTest軟件預熱10 min,將芯片放置掃描儀芯片卡槽中,開始掃描芯片,進行結果的判讀。

1.3.2最低抑菌濃度(MIC)藥敏試驗法 使用Sensititre MYCOTBI MIC法進行MIC測定試驗。每個測試批次中均包含作為對照的MTB H37Rv菌株(ATCC 27294)。分別依據1.0 μg/mL和0.5 μg/mL的臨界水平對MTB的耐藥性進行判讀,其中MIC≥4 μg/mL為高耐藥,MIC<4 μg/mL為低耐藥。

1.3.3比例法 采用藥敏試驗對痰標本進行4% NaOH/NaCl前處理后接種至液體培養管中,隨后置于MGIT960培養儀中培養。藥敏試驗嚴格按照美國BD公司MGIT960系統的操作步驟對其進行異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇4種一線抗結核藥物檢測,培養管內藥物終水平分別為0.1、1.0、1.0、5.0 μg/mL。

1.4統計學處理 采用Excel 2007進行數據錄入整理,使用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分比表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1表型檢測和MIC測定結果 51株耐藥MTB菌株中,有1株耐利福平單耐藥MTB,2株耐異煙肼單耐藥MTB,48株耐利福平、異煙肼耐多藥MTB。通過對23株耐多藥MTB菌株進行MIC藥敏試驗發現:對利福平而言,MIC>16 μg/mL有21株(91.30%),MIC=16 μg/mL有1株(4.35%),MIC=2 μg/mL有1株(4.35%),不同MIC耐多藥MTB菌株對利福平耐藥的構成比比較,差異有統計學意義(χ2=52.17,P<0.05);對異煙肼而言,MIC>4 μg/mL有10株(43.48%),MIC=4 μg/mL有7株(30.43%),MIC=2 μg/mL有1株(4.35%),MIC=1 μg/mL有2株(8.70%),MIC=0.25 μg/mL有2株(8.70%),MIC=0.12 μg/mL有1株(4.35%),不同MIC耐多藥MTB菌株對異煙肼耐藥的構成比比較,差異有統計學意義(χ2=6.72,P<0.05)。

2.2DNA微陣列基因芯片法結果 通過DNA微陣列芯片法對48株耐多藥MTB進行基因型檢測,結果顯示:對利福平rpoB基因而言,有6株為野生型(12.5%),點突變以531(C→T)突變型為主,有30株(62.5%),其余分別為516(A→T)突變型4株(8.3%)、526(C→T)突變型3株(6.3%)、526(C→G)突變型3株(6.3%)、533(T→C)和516(A→T)雙突變1株(2.1%),有1株出現了樣本異常,利福平rpoB基因不同突變型菌株的構成比比較,差異有統計學意義(χ2=52.84,P<0.05);對異煙肼katG、inhA基因而言,有14株野生型(29.2%),點突變以315(G→C)突變型為主,有25株(52.1%),其余分別為315(G→A)突變型3株(6.3%)、-15(C→T)突變型5株(10.4%)、315(G→C)和-15(C→T)雙突變型1株(2.1%),異煙肼katG、inhA基因不同突變型菌株的構成比比較,差異有統計學意義(χ2=34.12,P<0.05)。

2.3不同檢測法方法對MDR-TB檢測結果的比較 通過比例法、MIC法、基因芯片法對23例耐多藥MTB進行耐藥情況檢測顯示,3種方法檢測出的耐藥菌株均以耐利福平、異煙肼同時耐藥為主,但3種方法耐利福平、異煙肼菌株檢出率比較,差異無統計學意義(χ2=4.13,P>0.05)。見表1。

表1 比例法、MIC法、基因芯片法對MDR-TB檢測結果比較[n(%)]

2.4利福平耐藥基因突變類型在不同MIC的分布情況 88.9%的531(C→T)突變菌株MIC>16 μg/mL,5.6%的菌株MIC=16 μg/mL,5.6%的菌株MIC=2 μg/mL;4株526(C→T)突變型和1株516(A→T)突變型菌株的MIC均>16 μg/mL。見表2。

表2 利福平耐藥基因突變類型與MIC的關系[n(%)]

2.5異煙肼耐藥基因突變類型在不同MIC的分布情況 66.7%的野生型突變菌株MIC>4 μg/mL,33.3%的野生型突變菌株MIC=0.12 μg/mL;2株315(G→A)突變型菌株MIC=0.25 μg/mL,MIC=1 μg/mL和MIC>4 μg/mL的315(G→A)突變型菌株各1株;MIC≥4 μg/mL的315(G→C)突變菌株12株,1株315(G→C)突變菌株的MIC=1 μg/mL;1株-15(C→T)突變型菌株MIC=2 μg/mL,1株-15(C→T)突變型菌株MIC>4 μg/mL;1株315(G→C)和-15(C→T)雙突變型菌株MIC=4 μg/mL。見表3。

表3 異煙肼耐藥基因突變類型與MIC的關系[n(%)]

3 討 論

目前對于MTB耐藥的檢測主要有2種方法,其中一種為表型檢測,另外一種為基因型檢測。對MTB來說,抗生素的臨界水平或“斷點”指的是能夠抑制95%尚未接觸過任何抗菌藥物(“野生型”)的菌株的最低水平,通常代表最高的MIC,或者是用尚未接觸過藥物的野生型菌株所獲得的抑制生物體生長所需的抗生素的濃度。由于發現耐多藥MTB對相應的藥物有著不同的耐藥程度[4],筆者將收集到的耐多藥MTB進行MIC測定,其目的是分析耐多藥MTB的不同基因突變特征,以及MIC的變化情況。基因芯片技術由于其靈敏度和效率高,可作為傳統藥敏試驗的一種補充手段,尤其是對利福平和異煙肼耐藥菌株的檢測,從而有助于在臨床上如何制訂、實施有針對性的個體化治療和用藥方案[5]。比例法是目前大多醫院在使用的檢測MTB耐藥性的主要方法,但其檢驗周期較長,得到較純的培養物后還需要4周的時間才能得到結果,并且其較多的影響因素,煩瑣的操作步驟,易受干擾[6]。

本研究采用Sensititre MYCOTBI MIC法和DNA微陣列基因芯片法與比例法進行比對,結果顯示MIC法與比例法的符合率為95.7%,這與RICHTERA等[6]關于MIC法的研究一致。MIC法能較準確檢測出一線、二線抗結核藥物真實的MIC,且檢測周期較比例法短,有利于盡早為臨床醫生提供耐藥情況以便臨床治療。比例法和基因芯片法的符合率為87.0%,這與李丹等[7]關于基因芯片技術在分枝桿菌菌種鑒定和耐藥性分析中應用的研究一致。DNA微陣列基因芯片法檢驗周期短,高速,可靠,有利于耐藥結核分枝桿菌的早期檢測。

本研究結果表明,88.9%的531(C→T)耐利福平突變菌株中MIC>16 μg/mL,5.6%的531(C→T)耐利福平突變菌株MIC=16 μg/mL,5.6%的531(C→T)耐利福平突變菌株MIC=2 μg/mL,4株526(C→T)突變型和1株516(A→T)突變型均MIC>16,但由于所收集到的菌株數不足,未能發現密碼子511和533相關的MIC。有研究表明,密碼子531、516、526是可能導致MTB對利福平產生高耐藥水平的常見突變類型,511和533密碼子有可能會產生對利福平的低耐藥水平[8]。對代謝活躍的MTB,利福平具有顯著的殺菌作用。利福平是靶向DNA依賴性RNA聚合酶并抑制該菌轉錄的藥物,細菌RNA聚合酶基因的81堿基對區域中的突變rpoB(密碼子507～533)編碼酶的活性位點,其對所有利福平耐藥菌株的比例>95%[9]。本研究結果發現,對利福平rpoB基因而言,最常見的突變類型是531(C→T)突變型,其次是516(A→T)、526(C→T)、526(C→G)突變型。有研究顯示,在墨西哥常見的531(C→T)突變型是在RRDR中觀察到的最常見的突變[10]。ZAW等[11]的研究中指出,rpoB 531(C→T)是最常見的單核苷酸多態性(SNP),而密碼子526的突變是第2常見的SNP,即使在同一個國家,與耐利福平相關的rpoB基因突變也有很大差異。

耐多藥MTB中在DNA微陣列基因芯片中對關于異煙肼耐藥的katG和inhA基因中檢測,katG具有2 223 bp的長度并且合成參與霉菌酸合成的過氧化氫酶,katG基因中最普遍的突變是在密碼子315(Ser315→Thr;S315T)處的取代,發現其在40%～90%的耐異煙肼臨床MTB分離株中發生,因此被認為是可靠的檢測標記[12]。而inhA是FAS-Ⅱ系統的烯酰基-酰基載體蛋白(ACP)還原酶,其催化在與ACP相關的生長脂肪酸鏈的第二位雙鍵NADH依賴性還原,由于異煙肼在治療結核病患者方面的成功,inhA是臨床驗證的目標[13],試驗結果發現其主要的突變類型是315(G→C)突變型,然后是-15(C→T)突變型,其次是315(G→A)突變型,還有部分的315(G→C)和-15(C→T)雙突變型。50%～95%的耐異煙肼株中存在katG基因位點的第315密碼子突變,20%和35%的耐異煙肼株中存在著inhA調控區的突變。最常見的inhA突變發生在C15T位點,是在其的啟動子區,這一般與耐藥的單抗有關。inhA編碼區突變的菌株通常表現為對異煙肼的低水平耐藥。

本研究結果顯示,密碼子531、516、526可能是導致MTB對利福平產生高耐藥性的常見突變類型。katG315與異煙肼的高耐藥性相關,而inhA則較多與異煙肼的低耐藥性相關。利福平rpoB中最常見的突變類型是531(C→T)突變型,異煙肼中最常見的是katG315(G→C),其次是inhA-15(C→T)。本研究通過分析耐藥基因突變位點在不同藥物MIC的分布情況,快速獲得耐藥水平,有助于制訂治療方案和闡明耐藥機制,指導臨床用藥。