1種新的橫向主動脈縮窄大鼠模型構建方法▲

李曉莉 蔣智淵

(廣西醫科大學第一附屬醫院心血管內科,廣西南寧市 530021)

流行病學調查顯示,我國18歲以上人群高血壓患病率高達27.9%[1]。高血壓是導致心室肥厚最重要的病因,也是導致心力衰竭的主要危險因素。理想的動物模型可以為防治高血壓等心血管疾病提供研究基礎。橫向主動脈縮窄大鼠模型是用以研究壓力負荷增加所致左心室肥厚的病理生理過程和發病機制的重要動物模型。品質良好的動物模型應該具有對實驗動物創傷小、可復制率高、成模周期短、動物存活率高等特點。橫向主動脈縮窄大鼠模型的構建有多種方法,傳統的構建方法為經胸骨沿前正中線切開暴露主動脈弓后進行結扎[2],但該方法容易損傷滋養胸骨的大動脈和實驗動物的肺臟。Wang等[3]選擇經第2肋間隙作為開胸入路構建橫向主動脈縮窄大鼠模型,該手術方式雖然能在一定程度上避免因損傷胸骨造成的出血,但是大鼠的肋間隙空間較小,這不僅要求術者具有熟練的操作技術,而且會延長手術時間,從而增加麻醉和手術并發癥的發生。本研究對已有的橫向主動脈縮窄大鼠模型的構建方法[4]進行改良,即橫斷距胸骨正中約0.5 cm處的左側第3肋,經左側第2、3肋間隙進入胸腔暴露主動脈弓并進行結扎,并分析此改良方法與經胸骨開胸構建橫向主動脈縮窄大鼠模型在成功率和死亡率等方面的差異,從而優化構建主動脈弓縮窄大鼠模型的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級健康雄性SD大鼠36只,6～8周齡,體重(200±13)g,購于廣西醫科大學實驗動物中心(動物許可證:SCXK桂2020-0003)。將大鼠常規飼養于溫度為(25.0±0.5)℃、相對濕度為50%～60%、12 h明暗交替的環境,自由飲食。采用隨機數字表法將大鼠分為實驗組、胸骨切開組、對照組,每組12只。本實驗所有操作步驟均嚴格遵守中國實驗動物使用和護理的相關規定,并獲得廣西醫科大學動物福利與倫理審查會批準同意(批準編號:202107005)。

1.2 橫向主動脈縮窄大鼠模型的構建 實驗組采用橫斷距胸骨約0.5 cm的左側第3肋骨,經左側第2、3肋間隙開胸后結扎主動脈弓的方法構建模型,胸骨切開組采用傳統的直接開胸后結扎主動脈弓的方法構建模型,對照組的開胸方法與胸骨切開組一致,但不進行主動脈結扎縮窄操作。所有大鼠術前禁食8 h,自由飲水;術前稱量大鼠體重后,經腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉,待大鼠充分麻醉后,剃除大鼠左側肋弓以上的體毛,隨后將大鼠固定在加熱墊上,并打開加熱墊。經大鼠口腔插入氣管針[5],確認氣管針在大鼠氣道后,連接KW-10型小動物呼吸機(南京卡爾文生物科技有限公司),參數設置:潮氣量為3 mL/200 g,呼吸比為1 ∶1,頻率為80次/(min·200 g)。

以碘附消毒實驗組大鼠左側肋弓以上皮膚,然后剪開劍突至大鼠左鎖骨外側緣的皮膚,逐層分離大小胸肌,暴露肋骨,剪斷距胸骨正中約0.5 cm處的第3肋骨,隨后在橫斷第3肋的切口處,繼續往左側剪開皮膚、肌肉等組織以暴露第2、3肋間隙(圖1A、圖1B),之后用擴胸器擴開切口,暴露胸腔,分離左、右胸腺,尋找無名動脈、左鎖骨下動脈和左頸總動脈,以確定主動脈弓的位置,充分暴露主動脈弓后用5號手術縫線將自制的小于大鼠橫向主動脈直徑的縮窄針與大鼠橫向主動脈一起結扎(圖1C),確認結扎完全后拔出自制縮窄針,隨后觀察主動脈弓縮窄處凹陷程度,若結扎處較兩端血管凹陷,即可確認結扎成功。檢查無出血后用生理鹽水濕潤的紗布擦拭胸腺等組織,逐層關胸。

圖1 經左第2、3肋間隙開胸構建大鼠橫向主動脈縮窄模型

以碘附消毒胸骨切開組大鼠胸部正中線至鎖骨處皮膚,直接切開胸骨,然后用擴胸器垂直胸骨擴開切口,依照上述方法尋找主動脈弓并結扎縮窄。對照組開胸方法與胸骨切開組一致,但不進行后續的主動脈縮窄操作。

待大鼠恢復自主呼吸后,撤除小動物呼吸機。術后8 h恢復進食,密切觀察大鼠的基本情況。為了排除手術操作者熟練程度對實驗結果的影響,以上操作均由同一名術者獨立完成。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠死亡情況及手術時間:記錄實驗期間大鼠的死亡情況。比較實驗組與胸骨切開組的大鼠存活率及手術時間。

1.3.2 一般情況:術后每日觀察各組大鼠的手術傷口有無滲血、有無膿液滲出、是否有紅腫等表現,以及進食和排泄情況、體重增減情況、毛發光澤度,并通過觀察大鼠嘴唇、肢體、尾巴等部位的皮膚黏膜是否紅潤來判斷大鼠的循環情況。

1.3.3 心臟超聲指標:術后4周采用心臟超聲儀(Esaote公司,型號:EPX-3500HD)測量各組大鼠的心臟相關指標。通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對大鼠進行麻醉,充分麻醉后對大鼠胸部進行剃毛備皮,將其平放在操作臺的保溫墊上,同時使用B型和M型超聲儀在胸骨旁左室長軸切面、二尖瓣腱索水平進行測量。測量指標包括舒張末期室間隔厚度(interventricular septum thickness at end diastole,IVSTd)、舒張末期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole,LVPWTd)、舒張末期和收縮末期左室容積,然后計算左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF),LVEF=(左室舒張期容積-左室收縮期容積)/左室舒張期容積×100%。各指標均測量3個連續的心動周期,取均值。

1.3.4 心臟組織學指標:完成心臟超聲檢查后,通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)再次麻醉3組大鼠,剪開肋骨,用止血鉗夾住主動脈并快速剪下心臟置于生理鹽水,然后用50 mL注射器往主動脈注入生理鹽水以沖洗干凈余下的血液。取部分心臟標本,以4%多聚甲醛固定。取材完成后,取出4%多聚甲醛中的心肌組織并置于10%中性甲醛溶液固定2 d,經過蒸餾水沖洗、脫水等步驟后進行石蠟包埋切片,同時制備兩份石蠟切片,一份用于HE染色,另一份用于Masson染色,最后在相應倍數的光學顯微鏡下觀察。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數資料以例數(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠一般情況 實驗組12只大鼠中,1只在術后2 d因急性左心衰竭而死亡,最終共11只大鼠存活,存活率為91.7%。胸骨切開組12只大鼠中,2只因術中大出血而死亡,2只于術后3 d因急性心力衰竭而死亡,2只于術后7 d后因可疑肺水腫而死亡,最終共有6只大鼠存活,存活率為50.0%。實驗組的存活率高于胸骨切開組(χ2=5.042,P=0.034)。對照組12只大鼠中,2只因術中大出血而死亡,1只因擴胸器壓迫損傷肺造成氣胸而死亡,最終共9只大鼠存活,存活率為75.0%。統計存活大鼠的手術時間,實驗組的手術時間為(23.48±2.53)min,短于胸骨切開組的(36.03±3.59 )min(t=9.602,P<0.001)。

3組存活大鼠術后皆無術野滲血、傷口紅腫、化膿和滲液等情況,并且每日的排泄和進食量正常。大鼠的體重在術后前兩周增長最快,平均10 g/周。同時,大鼠的四肢、嘴唇和尾巴均保持紅潤,軀體活動也無明顯異常,精神良好。

2.2 3組大鼠心臟超聲指標的比較 與對照組比較,實驗組和胸骨切開組大鼠的IVSTd和LVPWTd均增厚(均P<0.05),但實驗組和胸骨切開組上述兩個指標差異無統計學意義(均P>0.05)。3組大鼠的LVEF差異無統計學意義(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 3組大鼠心臟超聲指標的比較(x±s)

圖2 3組大鼠典型的經胸骨旁左室長軸切面超聲影像

2.3 3組大鼠心肌組織學改變 HE染色結果顯示:對照組大鼠心肌組織未見明顯的炎癥細胞浸潤,心肌細胞形態、大小基本一致,細胞邊界清晰;實驗組和胸骨切開組大鼠心肌組織有較多炎癥細胞浸潤,心肌細胞形態各異,細胞邊緣分界不明顯,部分細胞體積變大、水腫。Masson染色結果顯示:對照組大鼠心肌細胞排列有序,少見膠原纖維組織填充;而實驗組和胸骨切開組大鼠心肌肌節排列紊亂,心肌細胞間有較多膠原纖維組織填充。見圖3。

圖3 3組大鼠心肌組織學變化

3 討 論

動物模型是研究疾病發病機制的基礎,理想的動物模型不僅要考慮實驗動物的倫理,盡量減少手術操作對實驗動物的傷害,而且還要考慮是否能很好地模擬疾病的發生和發展。橫向主動脈縮窄大鼠模型是一種通過縮窄動物主動脈弓管徑來增加大鼠心臟射血后負荷,利用壓力負荷改變心肌形態和功能,最終達到模擬人類高血壓、心力衰竭等疾病狀態的動物模型,該模型對研究心血管疾病具有重要的作用。既往以主動脈弓縮窄為主的橫向主動脈縮窄大鼠模型,多以大鼠正中線即胸骨作為手術入路[6],此方法雖然可以很好地顯露大鼠的心臟和主動脈,但胸骨作為大鼠較大的軀干骨,具有一定數量的滋養動脈,手術過程中如操作稍有不當可損傷動脈而造成出血。本研究中,采用胸骨切開入路的胸骨切開組和對照組,皆有2只大鼠因術中出現大出血而死亡。有研究表明,經肋間隙入路逐層分離暴露手術視野的方法可在一定程度上減少術中出血量,改善大鼠的預后[7]。但是即使使用擴胸器擴張大鼠肋間隙,操作空間仍較為有限,不利于隨后分離及結扎主動脈的精細操作,這有可能造成手術時間延長,以及麻醉和手術相關并發癥發生率的增加。此外,使用擴胸器強行擴張容易引起肋骨變形,不利于后期實驗動物的恢復。

研究表明,大鼠升主動脈經心臟發生后,在相當于第四胸椎水平穿出心包,形成主動脈弓,并向左向上走行,在相當于第2胸椎水平達到最高位置,并逐漸向足側走行,形成降主動脈,隨后在主動脈弓起點約10 mm處發出無名動脈,在主動脈弓最高位置后發出左頸總動脈和左鎖骨下動脈[8]。基于大鼠的主動脈解剖特點,我們認為在近胸骨處,左側第2、3肋間隙較易于暴露和結扎主動脈弓。因此,我們先橫斷距離大鼠胸骨約0.5 cm的左側第3肋,再從左側第2、3肋間隙進入,利用擴胸器擴開胸腔后進行后續操作。采用此方法開胸能夠在擴開肋骨并撥開左右兩片胸腺后快速找到主動脈弓,在較好的手術視野中進行結扎,而且此方法無須過多翻動大鼠胸腔內臟器,從而減少對實驗動物的傷害。本研究結果顯示,采用此方法進行建模的實驗組,無論是手術存活率還是手術時間,均優于胸骨切開組(均P<0.05)。此外,實驗組未出現術中大出血的情況。上述結果表明,改良的開胸結扎主動脈弓方法,不僅可以避免經胸骨切開結扎主動脈弓引發的大出血,還可以提高手術的安全性和縮短手術時間。

為了驗證改良方法構建橫向主動脈縮窄大鼠模型的有效性,本研究比較了3組大鼠的心臟超聲指標及心臟組織學變化。結果顯示,與對照組相比,實驗組和胸骨切開組大鼠均出現了明顯的左心室肥厚、心肌炎癥和心肌纖維化,而實驗組和經胸骨切開組大鼠的心臟超聲指標及心臟組織學變化均無明顯差異。上述結果表明改良與傳統的開胸結扎主動脈弓方法均能有效構建橫向主動脈縮窄誘導的壓力超負荷大鼠心肌肥厚模型。

然而,本研究改良的建模方法也存在不足:(1)本研究未能建立不橫斷肋骨而直接經左側第2、3肋間隙開胸結扎主動脈弓的對照組,只是推測改良方法可能優于經肋間隙開胸法,這有待今后進一步實驗驗證。(2)是否有比本研究改良方法更優的建模方式,還有待進一步探索。有研究表明,相比于經胸腔入路的建模方法,腹主動脈縮窄誘導的壓力超負荷心肌肥厚大鼠模型具有手術安全性高、實驗動物成活率較高等優點[9],但是腹主動脈縮窄的成模周期明顯延長[10],故本研究并未采用此種方法構建壓力超負荷心肌肥厚大鼠模型。此外,近期有研究報告,與傳統方法相比,經第2肋水平切開胸骨并結扎小鼠主動脈弓的創傷性更小,手術時間更短[11]。但是,在大鼠上建模是否也可獲得同樣的效果,且是否優于本研究的建模方法,都有待于今后的研究進一步證實。

綜上所述,與傳統的經胸骨正中開胸并結扎主動脈弓方法比較,通過橫斷距胸骨正中約0.5 cm處的第3肋,經左側第2、3肋間隙開胸后結扎主動脈弓的方法構建橫向主動脈縮窄大鼠模型,建模成功率高,手術時間明顯縮短。上述方法可以為科研工作者構建橫向主動脈縮窄大鼠模型提供參考。