血清miR-146b、ICAM-1與急性呼吸窘迫綜合征患者疾病嚴重程度、預后的關系▲

酈文捷 潘永良 黃曉敏 顧 俊

(1 南通大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科、南通大學醫學院,江蘇省南通市 226001;2 南通大學附屬丹陽醫院老年科,江蘇省丹陽市 212300)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種以肺泡滲透性增加和持續嚴重低氧血癥為特征的危重疾病,是急診ICU(emergency ICU,EICU)患者死亡的主要原因之一[1]。盡管關于ARDS發病機制和治療手段的研究已取得重大進展,但ARDS的原發疾病多樣、致病環節多、發病機制復雜,病死率仍高達40%～50%[2]。因此,早期評估ARDS患者病情嚴重程度和預后意義重大。研究表明,炎癥反應在ARDS發生與發展過程中扮演重要角色[3]。miRNA能通過剪切mRNA和抑制蛋白表達調控靶基因轉錄,在炎癥反應和免疫應答中發揮重要的調控作用[4]。研究表明,miR-146b能通過抑制髓樣分化因子88/核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路,減輕肺炎患兒的炎癥程度[5]。細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1是一種跨膜糖蛋白,能促進組織中受炎癥影響的效應器-靶細胞的相互作用[6]。本研究探討ARDS患者血清miR-146b、ICAM-1水平與其疾病嚴重程度和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2021年5月南通大學附屬丹陽醫院收治的186例ARDS患者作為研究對象。男性131例、女性55例,年齡28～76(52.68±4.47)歲,體質指數18～26(22.44±2.59)kg/m2;合并癥:高血壓34例、糖尿病18例、冠心病8例;病因:手術7例、肺挫傷13例、多發傷22例、重癥肺炎18例、嚴重感染126例。納入標準:(1)符合《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南(2006)》[7]中的ARDS診斷標準;(2)年齡18～80歲;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)合并心源性肺水腫、慢性阻塞性肺疾病、肺結核、肺心病、肺栓塞等疾病者;(2)合并血液系統、免疫系統疾病者;(3)心、肝、腎等重要臟器損害者;(4)妊娠及哺乳期婦女;(5)合并惡性腫瘤者。本研究已經過南通大學附屬丹陽醫院醫學倫理委員會批準,患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集資料:收集患者基線資料,包括性別、年齡、體質指數、合并癥、病因、機械通氣時間、EICU入住時間、入院時心率。

1.2.2 生化指標和ICAM-1的檢測:(1)于患者入院后6 h內,使用Radiometrie公司ABL80型動脈血氣分析儀測定PaO2水平,計算氧合指數,氧合指數=PaO2/吸氧濃度;使用Philips公司M3012AC10型脈搏指示連續心排血量監測儀測量血管外肺水指數(extravascular lung water index,EVLWI)。(2)采集患者入院時靜脈血3 mL,以3 000 r/min離心10 min (離心半徑為8 cm),取上清液備用。取部分上清液,采用ELISA測定血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、ICAM-1水平,所有操作嚴格按照上海梵態生物科技有限公司提供的試劑盒(批號:FT-P32761R、FT-P31372R、FT-P31375R、FT-P37980R)說明書進行。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測miR-146b表達水平:取另一部分上清液,采用TRIzol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號:R401-01)提取血清總RNA,用超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度,用TaKaRa反轉錄試劑盒(北京麥瑞博生物科技有限公司,批號:RR001A-1)將RNA反轉錄合成cDNA后進行實時熒光定量PCR擴增反應。miR-146b正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA-3′,反向引物序列為5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′;內參U6正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′,反向引物序列為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。反應體系(共20 μL):1 μL cDNA,2 μL正向引物,2 μL反向引物,10 μL SYBR Green Master Mix,5 μL ddH2O。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s,62℃ 退火及延伸40 s,共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-146b相對表達水平。

1.3 ARDS嚴重程度和預后評估 于患者入院時,根據2012年柏林標準[8]評估其疾病嚴重程度:輕度指氧合指數>200 mmHg,中度指氧合指數處于100～200 mmHg,重度指氧合指數≤100 mmHg。根據疾病嚴重程度將患者分為輕度組(n=45)、中度組(n=58)、重度組(n=83)。患者入院后根據《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南(2006)》[7]進行治療,根據治療28 d后的預后情況將其分為死亡組(n=52)和存活組(n=134)。

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數和百分比表示,組間比較采用χ2檢驗;正態分布的計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用Bonferroni法;偏態分布的計量資料以[M(P25,P75)]表示,組間比較采用秩和檢驗;采用Pearson相關分析法分析指標間的相關性;采用多因素Logistic回歸模型分析ARDS患者預后不良的影響因素;采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清miR-146b、ICAM-1水平對ARDS患者預后不良的預測價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同疾病嚴重程度患者的基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較 3組患者的性別、年齡、體質指數、合并癥、病因、入院時心率比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。輕度組、中度組、重度組患者的機械通氣時間、EICU入住時間、EVLWI和血清ICAM-1、TNF-α、IL-6水平均依次升高,氧合指數和血清miR-146b、IL-10水平均依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 不同疾病嚴重程度患者基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較

2.2 ARDS患者血清miR-146b、ICAM-1水平與氧合指數和炎癥因子水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示,ARDS患者血清miR-146b水平與氧合指數、血清IL-10水平呈正相關,與血清ICAM-1、TNF-α、IL-6水平呈負相關(均P<0.05);血清ICAM-1水平與氧合指數、血清IL-10水平均呈負相關,與血清TNF-α、IL-6水平均呈正相關(均P<0.05)。見表2。

2.3 不同預后患者的基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較 死亡組患者的機械通氣時間、EICU入住時間均長于存活組,氧合指數和血清miR-146b、IL-10水平均低于存活組,EVLWI和血清TNF-α、IL-6、ICAM-1水平均高于存活組(均P<0.05);兩組患者其余指標差異無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 不同預后患者的基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較

2.4 ARDS患者預后不良的影響因素分析 以機械通氣時間、EICU入住時間、EVLWI、氧合指數,以及血清TNF-α、IL-6、IL-10、miR-146b、ICAM-1水平為自變量(均以原值納入),以ARDS患者的預后情況為因變量(死亡=1,存活=0),納入多因素Logistic回歸模型進行分析。結果顯示,機械通氣時間延長、EVLWI和血清TNF-α、IL-6、ICAM-1水平升高是ARDS患者預后不良的獨立危險因素,氧合指數和血清IL-10、miR-146b水平升高為其獨立保護因素(均P<0.05)。見表4。

表4 ARDS患者預后不良的影響因素分析

2.5 血清miR-146b、ICAM-1水平對ARDS患者預后不良的預測價值 ROC曲線分析結果顯示,血清miR-146b、ICAM-1水平分別為0.63 ng/mL、852.20 ng/mL時,預測ARDS患者預后不良的曲線下面積分別為0.802(95%CI：0.738,0.857)、0.811(95%CI：0.748,0.865),敏感度分別為76.92%、88.46%,特異度分別為74.65%、64.18%。見圖1。

圖1 血清miR-146b、ICAM-1水平預測ARDS患者預后不良的ROC曲線圖

3 討 論

ARDS是臨床常見的重癥呼吸系統疾病,以肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流值失常為主要病理生理特征,因其致病因素繁多且發病機制復雜,一直是EICU醫護人員面臨的難題。目前研究認為,炎癥反應參與ARDS的發生和發展,肺臟在受到感染、創傷等損傷時能激活炎癥反應以修復損傷,但過度的炎癥反應會加劇肺泡上皮和血管內皮損害,導致肺功能持續惡化,最終引起ARDS[3]。

miRNA是一種長度為18～25個核苷酸的高度保守的非編碼RNA,能根據堿基互補配對原則特異性結合目標mRNA的3′-非翻譯區,間接調節基因表達,通過炎癥反應參與ARDS的發生和發展[9],如miR-216a能通過調節NF-κB信號通路來緩解脂多糖誘導的ARDS[10]。miR-146b定位于染色體10q24.32,作為參與免疫炎癥、癌癥等多種生物學過程的miR-146成員之一,其也被認為是先天性免疫反應和適應性免疫反應的調節劑,在免疫炎癥、癌癥發展過程中發揮重要作用[11-12]。Zhang等[11]使用脂多糖誘導構建狼瘡性腎炎細胞模型,發現腎系膜細胞中miR-146b表達受抑制,上調miR-146b表達能通過調節腫瘤壞死因子受體相關蛋白6抑制NF-κB信號通路,從而抑制脂多糖誘導的炎癥損傷。Toll樣受體在炎癥反應的啟動過程中發揮關鍵作用,Curtale等[12]發現,抗炎性細胞因子IL-10能誘導miR-146b表達,進而通過與Toll樣受體相關的腫瘤壞死因子受體相關蛋白6、白細胞介素 1受體相關激酶1、髓樣分化因子88信號通路來抑制TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子的表達。上述研究說明miR-146b具有抗炎作用。

TNF-α、IL-6是重要的促炎性細胞因子,IL-10是重要的抗炎性細胞因子,有研究表明這三者在ARDS炎癥反應中發揮重要作用[13]。本研究結果顯示,輕度組、中度組、重度組患者血清TNF-α、IL-6水平依次升高,IL-10水平依次降低(均P<0.05),說明ARDS患者機體存在明顯炎癥反應,與既往研究[3]結果相似。氧合指數是反映器官組織能否獲得足夠氧氣并進行氧合作用的指數,ARDS患者因頑固性低氧血癥、嚴重呼吸窘迫等原因而出現氧合指數顯著降低,因此2012年柏林標準根據氧合指數對ARDS患者進行病情分級[8]。本研究結果顯示,輕度組、中度組、重度組患者的血清miR-146b水平依次降低,且ARDS患者血清miR-146b水平與氧合指數呈正相關 (均P<0.05),說明miR-146b參與ARDS的發生和發展。本研究結果還顯示,ARDS患者血清miR-146b水平與血清IL-10水平呈正相關,與血清TNF-α、IL-6水平呈負相關(均P<0.05),提示miR-146b可能通過炎癥反應參與ARDS的發生和發展。He等[14]通過脂多糖誘導構建ARDS小鼠模型,發現miR-146b過表達能降低肺組織和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1的表達,改善小鼠肺通透性。本研究結果還顯示,血清miR-146b水平是ARDS患者預后的影響因素。ROC曲線分析結果顯示miR-146b預測ARDS患者預后不良的曲線下面積為0.802,說明miR-146b能作為評估ARDS預后的生物標志物。

ICAM能介導內皮細胞與內皮細胞間、內皮細胞與基質間的相互接觸和結合,參與細胞信號轉導與活化、炎癥反應、免疫應答等生物學過程[15]。ICAM-1基因定位于染色體19pl3.3-13.2,是一種位于內皮細胞表面的糖蛋白和黏附受體,在炎癥刺激時內皮細胞可大量分泌ICAM-1,ICAM-1能特異性結合其受體,招募腫瘤細胞、炎癥細胞、白細胞到內皮細胞,促使內皮細胞活化,增加內皮通透性,引起器官組織損傷[6]。中性粒細胞的激活和向肺泡空間的轉移是ARDS炎癥激活和大量促炎介質釋放的關鍵[3]。研究表明,ICAM-1廣泛表達于肺泡上皮細胞和血管內皮細胞,并在中性粒細胞招募和運輸到肺部的過程中起到關鍵作用[16]。研究表明,ICAM-1與哮喘、類風濕關節炎等免疫炎癥疾病有關[17-18]。本研究結果顯示,輕度組、中度組、重度組患者的血清ICAM-1水平依次升高,且ARDS患者血清ICAM-1水平與氧合指數呈負相關(均P<0.05),說明ICAM-1參與ARDS的發生和發展。本研究結果還顯示,ARDS患者血清ICAM-1水平與IL-10水平呈負相關,與TNF-α、IL-6水平呈正相關(均P<0.05),提示ICAM-1可能通過調控炎癥反應參與ARDS的發生和發展。于海容等[19]通過脂多糖誘導構建ARDS兔模型,發現ARDS兔肺組織中ICAM-1的表達水平隨著脂多糖干預時間的延長而升高,且隨著ICAM-1表達水平的升高,肺泡炎癥細胞浸潤加重、間隔增厚。本研究結果顯示,ICAM-1高表達的ARDS患者預后不良風險增加,ROC曲線也證實ICAM-1可作為評估ARDS預后的生物標志物。此外,ARDS患者血清miR-146b水平與ICAM-1水平呈負相關(P<0.05),說明二者參與了ARDS的發生和發展,并可作為評估ARDS患者預后的生物標志物。動物實驗顯示,ARDS模型大鼠肺組織中的miR-146b表達下調,ICAM-1表達上調,給予miR-146b干預后,ARDS模型大鼠肺組織中的ICAM-1表達下調,雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-146b能靶向結合ICAM-1的3′-非翻譯區,負向調控ICAM-1的表達[20]。該研究進一步證實了miR-146b和ICAM-1共同參與ARDS的發生和發展。

綜上所述,miR-146b、ICAM-1可能通過調控炎癥反應參與ARDS的發生和發展,與ARDS患者的疾病嚴重程度和預后相關,有望成為ARDS潛在的生物標志物和臨床治療靶點。但本研究樣本量較小,研究結論還需進行多中心、大樣本研究進一步驗證。