乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測方法

徐聰玲，鐘世歡，張思奇，黃 南，楊天明，王 輝

1 浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009

2 贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310009

關(guān)鍵字：酵母β-葡聚糖；離子色譜儀；乳制品；葡萄糖

0 引言

酵母β-葡聚糖具有增強動物免疫力、抗腫瘤、抗感染、降低膽固醇、促進傷口愈合等功能，2010年5月20號，被原衛(wèi)生部批準為新資源食品，可添加到乳制品、功能飲料、焙烤制品、糖果等食品中；2012年使用范圍再次擴大至較大嬰兒配方乳粉。此外，酵母β-葡聚糖還具有脂肪樣口感，可作為低卡路里食品添加劑，在色拉調(diào)料、奶酪類似物等冷凍甜點中作為脂肪替代物使用，具有廣泛的應(yīng)用價值，國內(nèi)已有乳品企業(yè)將其作為營養(yǎng)強化劑添加在產(chǎn)品中。但國內(nèi)目前沒有酵母β-葡聚糖在乳制品中定量檢測方法的國家標準和行業(yè)標準，因此，本文利用酵母β-葡聚糖是一種無味無臭不溶于水的多糖，且不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，可與蛋白、甘露聚糖或幾丁質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合[1]的特性建立了乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和材料

Thermo ICS 3000離子色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；3K15高速離心機，Sigma公司；AR223CN電子天平，奧豪斯（常州）儀器有限公司。

葡萄糖（C6H12O6）標準品（純度≥99%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；酵母β-葡聚糖（C6H12O6）n原料（純度≥80%），江蘇佰耀生物科技有限公司；鹽酸（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、氫氧化鈉（分析純），永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；50%氫氧化鈉溶液（w/w），上海安譜實驗科技股份有限公司；鈉型前處理小柱[填料為Na型強酸性陽離子交換樹脂（Na）]；色譜柱（DionexCarboPac PA10 4mm×250 mm）、色譜柱（DionexCarboPac PA1 4mm×250 mm）、色譜柱（DionexCarboPac PA2003mm×250 mm），賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 樣品預(yù)處理

沉淀蛋白：稱取1～5 g（精確到0.0001 g）乳粉樣品于離心管中，加入20 mL 60 ℃左右的水充分溶解，加入1 mL亞鐵氰化鉀溶液，再加入1 mL乙酸鋅溶液，渦旋混勻，高速離心2 min（6 000 r/min以上），棄掉上清液，得到沉淀。

水洗：向沉淀中加15 mL 60 ℃左右的水，渦旋至完全溶解，高速離心，棄掉上清液（反復(fù)用水清洗離心，至最后1 遍上清液中不含干擾物質(zhì)）。

酸水解：向沉淀中加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，121 ℃水解1 h，冷卻至室溫后用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0～7.0，稀釋定容至50 mL，用濾紙過濾，取濾液過鈉柱后，用0.22 μm濾膜過濾上機；酵母β-葡聚糖標準品或原料須與樣品同時酸水解，以便測得葡聚糖水解率。

空白試驗：除不加試樣外，其余處理同上。

1.3 溶液配制

（1）葡萄糖儲備液：準確稱取葡萄糖標準物質(zhì)10 mg（精確至0.1 mg），用水溶解稀釋后定容至10 mL。

（2）葡萄糖中間液：吸取葡萄糖儲備液1 mL，用水溶解稀釋后定容至10 mL。

（3）工作液：準確吸取適量葡萄糖中間液，用水溶解稀釋后定容至濃度為1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL的系列工作液。

（4）亞鐵氰化鉀溶液：稱取15.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解稀釋后定容至100 mL。

（5）乙酸鋅溶液：稱取30.0 g乙酸鋅，用水溶解稀釋后定容至100 mL。

（6）氫氧化鈉溶液（5 mol/L）：稱取20.0 g氫氧化鈉，用水溶解稀釋后定容至100 mL。

1.4 儀器條件

色譜條件：流速：0.5 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：35 ℃。流動相：15 mmol/L氫氧化鈉溶液[50%氫氧化鈉溶液（w/w）配制]；等度洗脫。

檢測器：脈沖安培檢測器，Au工作電極，AgCl參比電極。

檢測池溫度：30 ℃。

1.5 結(jié)果計算

根據(jù)標準曲線計算得出對應(yīng)的樣品濃度C，由公式①計算出樣品中被測物的含量：

其中X：樣品中酵母β-葡聚糖含量，單位為mg/100 g；C：由標準曲線計算測得樣品中葡萄糖濃度，單位為μg/mL；V：樣品的最終定容體積，單位為mL；f：稀釋倍數(shù)；m：稱樣量，單位為g；100：100 g樣品中被測物含量；1 000：μg與mg之間轉(zhuǎn)換系數(shù)；F：酵母β-葡聚糖水解校正因子，F(xiàn)=1/葡聚糖標準品水解率 。

其中0.9：葡萄糖轉(zhuǎn)換為葡聚糖的系數(shù)；C1：酵母β-葡聚糖原料水解定容液上機測得的葡萄糖含量（g/mL）；V1：酵母β-葡聚糖原料水解后定容體積，單位為mL；W1：酵母β-葡聚糖質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗考察了用于酵母β-葡聚糖檢測的DionexCarboPac PA10 4×250 mm、DionexCarboPac PA14×250 mm和DionexCarboPac PA200 3×250 mm三種色譜柱上的最佳分離條件，試驗結(jié)果表明，DionexCarboPac PA200 3×250 mm色譜柱上葡萄糖出峰時間太早。改用DionexCarboPac PA14×250 mm后，樣品中葡萄糖的分離度不理想；而DionexCarboPac PA10 4×250 mm色譜柱在出峰時間及分離度都能滿足檢測要求。因此，試驗選擇DionexCarboPac PA10 4×250 mm色譜柱。

2.2 樣品前處理條件的確定

2.2.1 水洗次數(shù)確定

本試驗的研究對象是乳制品，乳制品中含有乳糖，且乳糖充分水解產(chǎn)物為葡萄糖和半乳糖，而酵母β-葡聚糖不溶于水，因此前處理通過沉淀劑得到粗沉淀后，用去離子水反復(fù)清洗，直至無干擾。再用1 mol/L鹽酸121 ℃高壓水解60 min，調(diào)節(jié)pH值稀釋定容后，過鈉柱，去除多余的金屬離子。在酸水解、儀器條件一致的情況下，干擾物隨著水洗次數(shù)增多而慢慢減少，直至水洗7 次后趨近為0。結(jié)果如圖1所示，確定水洗次數(shù)不少于7 次。

圖1 水洗次數(shù)對干擾物含量的影響

2.2.2 沉淀劑選擇

根據(jù)表1試驗結(jié)果，最后選擇亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液沉淀蛋白。

表1 3 種沉淀劑對樣品沉淀效果及檢測結(jié)果的影響

2.3 方法標準曲線、線性范圍及回收率

配制5水平的工作溶液，在選定的色譜條件下，以目標物峰面積為縱坐標、以目標物的濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程，結(jié)果如表2所示。在1 μg/mL，2 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.99911。

表2 標準溶液曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)

對某品牌乳粉、純牛奶及濃奶進行加標回收試驗，加入3 個不同濃度的酵母β-葡聚糖，每個濃度平行測定6 次，回收率結(jié)果見表3。酵母β-葡聚糖的平均回收率分別為81.5%～94.9%，相對標準偏差分別為0.80%～4.71%，本方法的準確度均滿足試驗分析要求。

表3 酵母β-葡聚糖平均加標回收率及相對標準偏差（n=6）

2.4 實際樣品測定

已采用本方法對現(xiàn)有樣品檢測108 批次，檢測結(jié)果滿意（表4）。

表4 某品牌幼兒配方乳粉、液奶及濃奶中酵母β-葡聚糖的檢測結(jié)果

2.5 標準品及樣品圖譜

標準品及樣品圖譜見圖2、圖3。

圖2 標準品圖譜

圖3 樣品圖譜

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化前處理條件及離子色譜條件，建立了乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測方法。根據(jù)酵母β-葡聚糖的特性，用沉淀劑沉淀蛋白，再用熱水反復(fù)沖洗沉淀，將基質(zhì)中水溶性雜質(zhì)除掉，然后用一元酸在高溫高壓下將沉淀中目標物水解成葡萄糖，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值后，定容。由于處理過程中用到的沉淀劑含有金屬離子，對檢測器及色譜柱都有影響。雖然氫氧化鈉溶液沉淀一部分鐵離子，但并不完全，因此，樣液需要過鈉柱，減少金屬離子對儀器及色譜柱的損壞，再經(jīng)離子色譜柱-脈沖安培檢測器測定葡萄糖的含量，通過換算系數(shù)折算得到酵母β-葡聚糖的含量。

該方法準確可靠，結(jié)果重現(xiàn)性良好，回收率高，實用價值高，適用于乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測。