超高溫滅菌乳中脂肪球粒徑快速檢測研究

馮立玲，胥文玲，羅軍昆，王清華，白曉玲

蒙牛乳業（灤南）有限責任公司，河北唐山 063500

0 引言

超高溫滅菌乳的保質期時間較長，在儲存過程會存在多種質量缺陷，如脂肪上浮、結塊、酸包、脹包等問題。其中脂肪上浮現象一直是影響長貨架期超高溫滅菌乳等乳制品質量的首要問題。不同程度的脂肪上浮現象均影響產品的外觀及品質，嚴重時在包裝頂部可形成幾毫米厚的脂肪層，給消費者食用時帶來不愉悅的感受和體驗。降低或減少脂肪上浮現象，成為乳品企業改善產品品質的重要環節。

牛奶中的脂肪以小液滴形式存在，稱為乳脂肪球[1]。牛奶中的脂肪球由于粒度大小不等、密度小、質量輕而浮在牛奶表面形成一層奶油層，使牛奶產生分層現象[2]，因此需要進行均質化處理。均質化處理給牛奶帶來許多優點，如脂肪球變小，不形成奶油層；顏色更白、口感更佳；降低脂肪氧化敏感性，具有更強穩定性和更長保質期[3～5]，成為了現代乳制品生產中不可或缺的工藝[6]。

為監控均質化效果，對均質化過程中牛奶脂肪球粒度的測定十分必要。激光粒度法作為一種快速、準確的粒度測試方法已被應用，但激光粒度分析儀較貴，檢測成本較高，一般乳品企業無法承擔[7]。為促進生產過程均質效果改善，同時提升產品穩定性，需研發一種低成本、高效率、快速檢測脂肪球粒徑大小的方法。本文通過試驗論述脂肪球粒徑檢測方法的研發過程，對比不同染色劑染色脂肪球的現象差異，從而確定出最優方案。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘇丹Ⅲ，福晨（天津）化學試劑有限公司；甲基紅、次甲基藍、鉻黑T、溴甲酚綠、甲基橙、95%濃度乙醇、草酸銨，福晨（天津）化學試劑有限公司；結晶紫、番紅，北京陸橋技術股份有限公司。

ME2002E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RX50顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；玻璃燒杯；載玻片；蓋玻片；滴管；鑷子。

1.2 染色劑選擇

蘇丹Ⅲ是一種常用的脂肪類染液，遇脂肪會變為橘黃色。甲基橙是分析化學中常用酸堿指示劑，在中性介質中以磺酸鈉鹽形式存在而呈現黃色，超高溫滅菌乳通常為中性樣品，可制備甲基橙指示劑用于該試驗。另外，甲基紅指示劑、次甲基藍指示劑、鉻黑T指示劑、溴甲酚綠指示劑、結晶紫指示劑、番紅指示劑均為實驗室日常檢測常用指示劑，本文引入這些指示劑用來進行試驗，對比染色效果。

1.3 試劑配制

蘇丹Ⅲ指示劑：稱取0.25 g蘇丹Ⅲ粉末于錐形瓶中，加入95%濃度酒精50 mL，充分攪拌混合均勻，過濾后備用。

甲基紅指示劑：稱取0.1 g甲基紅，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

次甲基藍指示劑：稱取0.1 g亞甲基藍，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

鉻黑T指示劑：稱取0.5 g鉻黑T，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

溴甲酚綠指示劑：稱取0.1 g溴甲酚綠，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

甲基橙指示劑：稱取0.1 g甲基橙，溶于70 ℃水中，冷卻，稀釋至100 mL。

結晶紫指示劑：稱取0.1 g甲基紅，用20 mL 95%乙醇溶解；稱取草酸銨0.8 g，用80 mL實驗用水溶解；使用前將上述兩種溶液混合過濾后備用。

番紅指示劑：稱取2.5 g甲基紅，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。使用前取10 mL已配制的溶液，加入90 mL實驗用水混勻后備用。

1.4 染色方法

待測樣品與染色劑混勻后直接檢測，無需其他處理。另外，為降低試驗操作過程中使用酒精燈存在的安全風險，減少常規制片過程使用酒精燈烘干的操作步驟，借鑒生物檢驗花生中的脂肪實驗操作步驟[8]中染色制片方法。除蘇丹Ⅲ染色法外，本文通過使用蓋玻片，驗證液體樣品不烘干也能實現固定的目的。

1.4.1 蘇丹Ⅲ染色法

參考《牛奶脂肪球觀測方法》[9]，具體操作步驟如下。

（1）制片：取若干滴牛奶置于載玻片上，用鑷子固定玻片一端置于酒精燈火焰上方，直至牛奶滴烘干。

（2）染色：在烘干后的牛奶滴上滴加蘇丹Ⅲ指示劑，靜置染色1～2 min，然后用鑷子夾住載玻片一端置于酒精燈火焰上方，直至蘇丹Ⅲ指示劑烘干。

（3）觀察：將載玻片置于顯微鏡下，選取放大倍數為10 倍的物鏡，在100 倍（10×10）條件下，觀察染色后牛奶滴中的脂肪球。

1.4.2 甲基橙染色法

（1）制片染色：取1 滴已混合均勻的牛奶樣品置于載玻片上，在滴加牛奶樣品的位置滴加1 滴甲基橙指示劑，再將一片蓋玻片用鑷子輕輕覆蓋在上面。

（2）分析觀察：將步驟（1）制備好的樣品置于顯微鏡下，在100 倍（10×10）條件下觀察?？芍苯佑媚跨R，也可用顯微鏡軟件進行觀察。

（3）結果判定 ：將載玻片置于顯微鏡下，選取放大倍數為10 倍的物鏡，在100 倍（10×10）條件下，觀察染色后牛奶滴中的脂肪球，也可以利用顯微鏡操作軟件，通過軟件參數設置，更直接、更清晰觀察脂肪球形態，還可測量脂肪球粒徑大小。

1.4.3 其他染色劑法

將結晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍、鉻黑T指示劑，依據1.4.2步驟操作。

1.5 結果判定

鏡檢觀察：未經均質處理或均質效果差的樣品，脂肪球大小不均勻，外形不規則，形態較大。經均質處理后的樣品，脂肪球為大小均勻的球形顆粒，形態較小。

本文試驗要求鏡檢觀察的結果為脂肪球外形清晰可見，粒徑大小可通過測量確定具體數值。

2 結果與分析

2.1 試驗結果

2.1.1 不同染色劑對比

針對試驗使用的8 種染色劑，在操作便捷性、觀察難易性、染色均勻程度及背景清晰程度等方面進行比較（表1）。甲基橙染色法較其他方法優勢更明顯。

表1 不同染色方法操作對比

2.1.2 染色劑與樣品的適宜性

抽取超高溫滅菌乳和調制乳各10 批，分別用8種染色劑進行樣品適宜性驗證（表2）。

表2 不同染色方法樣品適宜性對比

適宜性評價標準：染色劑與樣品充分融合，染色均勻，鏡檢觀察時無背景雜質干擾。

除甲基橙外，其他染色劑與樣品混合的過程中均存在不能充分融合的現象，鏡檢時視野下背景干擾影響觀察效果，故甲基橙染色法較其他方法優勢更明顯。

2.1.3 不同染色劑染色圖片

用顯微鏡觀察8 種不同染色劑對同一超高溫滅菌乳進行脂肪球染色，各種染色劑染色效果存在差異，其中甲基橙染色效果最好，背景最清晰，染色后的脂肪球更易觀察；相比而言，其他染色劑染色效果較差，染色后的脂肪球不易觀察（圖1）。

圖1 不同染色劑染色圖片

2.2 分析方法評價

2.2.1 蘇丹Ⅲ染色法

蘇丹Ⅲ染色法為已有參考文獻可查詢的一種脂肪球檢測方法，在試驗中發現存在4 處缺陷，具體如下。

（1）試劑配制：蘇丹Ⅲ染液配制過程存在溶解不充分現象，需過濾操作，步驟繁瑣。

（2）制片：由于需觀測樣品為液體，具有流動性，依據染色操作要求，為便于觀察，該方法對液體樣品通過烘干操作進行固定。執行該步驟需使用酒精燈，由于牛奶營養物質豐富，經烘干操作后，部分有機物由于烘烤溫度過高或時間過長容易糊化，染色后背景雜質較多，導致脂肪球不易觀察，干擾實驗人員操作，因此烘干環節需優化或取消。另外，酒精燈存在火災風險。

（3）烘干：酒精純度越高，燃燒越充分，燃點越旺盛。該方法使用濃度為95%乙醇配制染色液，染色后烘干操作，載玻片經過酒精燈火焰時，極易引起燃燒，危險性較大。

（4）染色：該步驟需靜置后再次使用酒精燈烘干，耗時較長。

2.2.2 甲基橙染色法

該方法操作簡便、快捷高效，具體優勢如下。

（1）取1 滴混勻后的樣品即可滿足實驗要求，不需烘干操作，立即滴加染色液，可實現染色均勻目的。

（2）染色后無需靜置，增加蓋玻片使用。蓋玻片的作用：可使被觀察物形成薄膜，易透光，便于觀察；可使標本相對固定；便于利用毛細現象，使染色液形成梯度，脂肪球染色更充分；避免標本受污染。

2.2.3 其他染色劑法

結晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍、鉻黑T指示劑滴加至牛奶樣品后，指示劑和牛奶樣品都不能有效融合，產生肉眼可見顆粒物質，鏡檢時會發現染色效果差，背景干擾雜質多，影響觀察效果。

3 結論與討論

為降低超高溫滅菌乳貨架期內脂肪上浮現象，在牛奶均質化及產品穩定性研究過程中，對脂肪球粒徑進行監控十分必要。在注重產品質量同時，考慮檢測效率成本等因素，乳品企業尤其需高效率、低成本、快速檢測脂肪球粒徑的方法。

本文對實驗室日常使用指示劑進行設計，在超高溫滅菌乳中開展脂肪球檢測試驗對比，最終確定甲基橙染色法為最優方法。傳統顯微鏡直接觀察方式，只能獲得脂肪球大小的直觀表象，不能了解具體粒徑大小。甲基橙染色法引入顯微鏡操作軟件，通過軟件參數設置，不但可以更直接更清晰觀察到脂肪球的形態，還可對脂肪球粒徑大小進行測量。同時，所觀察過的圖片可通過軟件存儲，便于后期查閱。該方法快速高效，檢測成本低，簡便易行，操作更安全，可為均質化過程提供有效監控數據，能滿足乳品企業對脂肪球粒徑進行快速檢測目的。