炎性細胞因子及淋巴細胞對突發性耳聾的診斷價值研究

張 園,王 樂,李紅敏,郝少娟,朱曉丹,葉放蕾

(鄭州大學第一附屬醫院耳科,河南 鄭州 450000)

突發性耳聾(簡稱突聾)是耳鼻喉科常見急癥之一,患者通常在72小時內出現至少2個連續頻率聽力損失≥20 dB HL的感音神經性聽力損失,部分伴有耳鳴、眩暈、嘔吐等癥狀,嚴重影響患者的正常生活與工作[1]。目前突聾病因及發病機制仍不明確,因此缺乏確切有效的治療方法。既往的研究表明突聾患者外周血中炎性細胞因子和淋巴細胞亞群發生改變,暗示了免疫紊亂參與突聾的發生過程[2, 3]。固有免疫細胞和適應性免疫細胞均存在于耳蝸中,在受到損傷性應激反應時,免疫細胞數量增加,B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK淋巴細胞、巨噬細胞是耳蝸中存在的主要免疫細胞[4, 5],說明外周血循環中的免疫細胞可進入耳蝸,參與耳蝸病變過程。本研究主要觀察炎性細胞因子和淋巴細胞亞群改變,并分析其對突發性耳聾的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2021年10月至2022年1月本院耳科收治的90例突聾住院患者為突聾組,納入標準:符合《突發性聾診斷和治療指南(2015)》[1](以下簡稱“指南”)中診斷及分型標準;首次發病,入院前無相關治療;自愿于本院接受治療,且住院期間病因未完全明確;有完善聽力學、影像學及實驗室檢查。排除標準:存在除聽神經外其他顱內神經受損癥狀;合并中耳病變、蝸后病變、創傷性聾、感染性聾等;合并心腦血管疾病、免疫系統疾病、血液系統疾病、糖尿病等其他嚴重全身性疾病;入院前3個月內有激素類藥物、非甾體抗炎藥、抗血小板藥、降脂藥等應用;無法按要求完成治療。另選取同期40例健康體檢者為對照組,對照組雙耳聽力檢測正常,且無任何耳科疾病、嚴重全身系統疾病。突聾組男49例,女41例,年齡9～76歲[(43.06±15.37)歲];發病側:左側39例,右側51例;對照組男18例,女22例,年齡20～63歲[(42.18±12.25)歲]。兩組受試者性別、年齡、側別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究符合赫爾辛基宣言,獲醫院倫理委員會批準。

1.2 方法突聾患者采集入院第2天外周血空腹靜脈血標本6 ml,體檢健康患者于體檢時采集靜脈血6 ml,分成兩部分,一部分血液樣本采用流式細胞儀分析CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK淋巴細胞絕對數及其所占比列,另一部分血液樣本室溫靜置15 min后,采用6000 r/min離心處理10 min,取上層血清采用酶聯免疫吸附法檢測血清白細胞介素(IL)-4、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-2、IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17A的表達水平。

1.3 觀察指標①對比突聾組與對照組IL-4、IL-6、TNF-α、IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-17A的表達水平;②對比突聾組與對照組CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK淋巴細胞絕對計數及其所占百分比和CD4/CD8比值;③對比突聾組與對照組差異有意義的炎性細胞因子和淋巴細胞受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)、敏感度和特異度。

1.4 統計學方法采用GraphPad Prism7.0軟件進行統計分析,計量資料用均數±標準差描述,兩兩比較行LSD-t檢驗;受試者工作特征(ROC)曲線評價炎性細胞因子和淋巴細胞對突聾的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組炎性細胞因子比較突聾組IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ水平高于對照組(P<0.05),兩組IL-2、IL-17A水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組炎性細胞因子指標比較 (pg/ml)

2.2 兩組淋巴細胞比較突聾組CD3+T淋巴細胞絕對計數及其所占百分比與對照組差異無統計學意義(P>0.05),CD4+T淋巴細胞絕對計數高于對照組(P<0.05),CD8+T淋巴細胞絕對計數低于對照組(P<0.05),但組間兩者所占百分比比較,差異無統計學意義(P>0.05),CD4/CD8比值高于對照組(P<0.05),B淋巴細胞絕對計數高于對照組(P<0.05),但其所占百分比與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05),NK淋巴細胞絕對計數及其所占百分比低于對照組(P<0.05),總淋巴細胞絕對計數低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組淋巴細胞指標比較

2.3 炎性細胞因子對突聾的診斷價值ROC曲線結果顯示血清 IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ診斷突聾的曲線下面積(AUC)分別為0.685、0.646、0.667、0.601、0.608,敏感度分別為45.56%、40.00%、36.67%、31.11%、44.44%,特異度分別為92.50%、97.50%、95.00%、90.00%、75.00%。見圖1和表3。

圖1 炎性細胞因子診斷突聾的ROC曲線

表3 炎性細胞因子對突聾的診斷價值

2.4 淋巴細胞對突聾的診斷價值ROC曲線結果顯示CD4+T、CD8+T、B、NK、總淋巴細胞絕對計數和CD4/CD8診斷突聾的曲線下面積分別為0.577、0.706、0.601、0.741、0.754、0.629,敏感度分別為28.89%、46.67%、22.22%、48.99%、50%、41.11%,特異度分別為100.00%、90.00%、97.50%、100.00%、100.00%、85.00%。見圖2和表4。

圖2 淋巴細胞診斷突聾的ROC曲線

表4 淋巴細胞對突聾的診斷價值

3 討論

目前突聾的病因仍不明確,近年來隨著病理激活細胞應激途徑假說的提出,人們開始認識到免疫反應可能在突聾的發病機制中發揮重要作用。目前,對突聾病因的研究主要集中在其與慢性炎癥的關系上[6]。Diao研究認為血小板/淋巴細胞值越高,突聾患者聽力治療預后越好[7]。中性粒細胞/淋巴細胞值也可做為判斷突聾發病和預后的生物標志物[8]。Chien發現IL-1與突聾患者的聽力損失密切相關[9]。內耳被認為是無側支循環的“終末器官”,其供血主要依靠迷路動脈。耳蝸中的毛細胞消耗大量氧氣,對缺氧極為敏感。因此,血流減少會導致突聾。炎癥反應可破壞內耳血管內皮,破壞內耳血流,誘發動脈粥樣硬化形成,進而損傷血管紋,增加缺血風險[8]?？寡最惞檀荚谕幻@治療中的廣泛應用也證實了免疫反應在其發病機制中的重要作用。

Zhang等研究表明IL-4與GJB2相關嬰兒聽力損失的嚴重程度沒有明顯相關性[10],Hiramatsu研究顯示IL-4R基因多態性與突聾的風險不相關[6],本研究顯示與對照組相比,突聾組IL-4的水平升高。IL-10受體主要表達于耳蝸外側壁,IL-10信號對于保護耳蝸免受炎癥引起的組織損傷至關重要,但IL-10抑制耳蝸炎癥的分子通路仍不清楚[11]。IL-10缺乏可加重實驗誘導的自身免疫性聽力損失,其通過抑制Th1型促炎反應來控制自身免疫反應嚴重程度[12]。既往研究報道IL-10水平越高,GJB2相關嬰兒聽力損失程度越重[10]。但IL-10的水平在突聾患者外周血中無明顯改變[13]。在本研究中,突聾組較對照組IL-10的水平升高。以上研究結果提示了IL-4和IL-10可能在突聾中發揮作用,IL-4和IL-10均屬于抗炎因子,這暗示了在突聾的發生和發展過程中,體內可能啟動了抗炎免疫反應。

研究表明噪音刺激后耳蝸內炎癥因子水平增高,免疫細胞數量增多[14]。噪音可誘導炎癥因子的表達,包括IL-6和TNF-α,IL-6表達于血管紋、螺旋神經元和螺旋韌帶[15]。攜帶IL-6-174 CC基因型的人群比GG基因型更易受到噪聲影響,患噪音性耳聾[16]。應用抗IL-6受體抗體MR16-1抑制來自IL-6的信號可以抑制耳蝸炎癥反應,改善聽力[17]。IL-6水平越高,GJB2相關嬰兒越易發生重度聽力損失[10]。先前的研究顯示IL-6基因多態性與突聾的風險顯著相關,且突聾患者外周血中IL-6的水平升高[3, 6]。我們的研究顯示與對照組相比,突聾組IL-6的水平升高,與既往研究結果一致,提示了IL-6可能在突聾中發揮作用。

順鉑導致的藥物性耳聾中炎癥因子表達明顯升高,包括IL-6和TNF-α,TNF-α表達于Corti器官、螺旋韌帶和血管紋,給予TNF-α抑制劑依那西普治療后,可明顯抑制炎癥因子的表達,減輕順鉑對毛細胞的損害,暗示了促炎因子,尤其是TNF-α,在順鉑引起的毛細胞損害中發揮核心作用[18]。有研究發現突聾患者外周血中TNF-α的水平明顯升高[13, 19],也有研究認為突聾的風險與TNF-α基因多態性無明顯相關性[10]。本研究顯示突聾組TNF-α的水平比對照組升高,提示了TNF-α可能在突聾中發揮作用。

先前有研究表明突聾患者外周血中IFN-γ的水平明顯降低[13],亦有研究顯示IFN-γ的水平不與GJB2相關嬰兒聽力損失的嚴重程度相關[10],在我們的研究中,突聾組IFN-γ的水平比對照組升高,提示了IFN-γ可能在突聾中發揮作用。IL-6、TNF-α和IFN-γ均屬于促炎因子,這暗示了在突聾的發生和發展過程中,體內可能啟動了促炎免疫反應。抗炎免疫反應和促炎免疫反應相互作用,可能決定了突聾的發生、聽力損失程度以及治療效果。

既往有研究顯示IL-2和IL-17不與GJB2相關嬰兒聽力損失的嚴重程度相關[10],但IL-2的水平在突聾患者外周血中明顯降低[13],我們的數據顯示突聾組和對照組之間IL-2和IL-17A沒有明顯統計學差異,IL-2和IL-17A在突聾中的作用仍需要繼續探索。我們的研究結果與既往研究結果存在不一致,鑒于突聾患者的研究樣本量小,沒有進一步根據聽力損失的程度、不同頻率和時間長短對突聾分型,從而分析炎性細胞因子表達的差異性,未來需要進一步擴大樣本量去具體分析炎性細胞因子在突聾中的作用。

越來越多的證據表明免疫調節細胞,特別是T淋巴細胞可能參與突聾的發生。Mayot研究發現突聾患者外周血中CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞嚴重耗竭,CD8+T淋巴細胞顯著減少[2]。Garcia-Berrocal研究發現突聾患者外周血中CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞減少,對激素治療反應好的患者CD4+T淋巴細胞數量趨于恢復正常,而CD8+T淋巴細胞仍繼續有輕微下降。B淋巴細胞和NK淋巴細胞數量在治療前和治療后沒有明顯差異[20]。Kassner研究發現突聾患者外周血CD3+T淋巴細胞減少,B淋巴細胞增多[19]。我們的數據顯示突聾組CD4+T淋巴細胞絕對計數高于對照組,CD8+T淋巴細胞絕對計數低于對照組,但組間兩者所占百分比比較,差異無統計學意義,CD4/CD8比值高于對照組,B淋巴細胞絕對計數高于對照組,但其所占百分比與對照組比較,差異無統計學意義,NK淋巴細胞絕對計數及其所占百分比低于對照組,總淋巴細胞絕對計數低于對照組,提示了淋巴細胞可能在突聾中發揮作用,但仍需要更多的樣本量去具體分析每一種細胞的作用,且具體的作用機制也仍需探索。

突聾的ROC曲線顯示IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、CD4+T、CD8+T、B、NK、總淋巴細胞絕對計數和CD4/CD8診斷突聾的AUC值均大于0.5,雖然敏感度較差,但特異度較高,說明它們可在一定程度上診斷突聾的發生。

綜合以上數據發現雖然我們的研究結果與既往研究結果存在不一致,但突聾患者外周血炎性細胞因子和淋巴細胞確實發生異常改變,免疫反應參與了突聾的發生和進展,因此可能被認為是一種新的治療靶點。