拉帕替尼和阿司匹林雙聯化合物的設計、合成及其體外活性研究

袁盼盼 郭凱麗 姚 琳 過曉芳 劉繼平 王 斌 王國全 朱星枚

1.陜西中醫藥大學陜西省中醫藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西咸陽 712046；

2.陜西省中醫藥管理局中藥藥效與物質基礎重點實驗室，陜西咸陽 712046；

3.空軍軍醫大學藥學系藥物化學與藥物分析教研室，陜西西安 710032；

4.西安工業大學理學院，陜西西安 710021

研究表明，原癌基因人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）在15%～20%的乳腺癌中過度表達，與乳腺癌的發生、發展和預后密切相關[1-2]。拉帕替尼是繼曲妥珠單抗之后第2個被美國FDA 批準用于HER2 陽性乳腺癌的分子靶向藥物[3-4]。但是，拉帕替尼的單藥響應率僅為24%，大多數患者在用藥6 個月左右出現耐藥[5-6]。阿司匹林是常見的非甾體類抗炎藥，已被證明具有較廣譜的抗腫瘤作用[7-10]。臨床研究表明，阿司匹林對PIK3CA 突變型乳腺癌患者有效[11-12]。課題組前期實驗表明，低劑量阿司匹林聯合拉帕替尼用藥較單用拉帕替尼或阿司匹林，可以更有效地抑制HER2 陽性乳腺癌細胞增殖，顯著增強腫瘤細胞凋亡率[13]。鑒于此，本研究設計、合成了阿司匹林和拉帕替尼的孿藥（CompdⅠ），希望其能發揮兩藥協同抗HER2 陽性乳腺癌的作用。本研究初步評價了CompdⅠ抗HER2 陽性乳腺癌的作用，采用分子對接技術[14]探討了其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器

HF240 細胞培養箱[力新儀器（上海）有限公司]；酶標儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；蛋白凝膠電泳儀[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]；TGL-16M 冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；JY 92-IIN 超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；GBOX-Chemt-XRQ 化學發光成像系統（基因有限公司）；AVANCE NEO 400M 核磁共振儀、Bruker micro TOF-Q Ⅱ高分辨質譜儀[布魯克（中國）有限公司]。

1.2 試劑與細胞

胎牛血清（GEMINI，批號：A44H102L）；RPMI 1640培養基（Hyclon，批號：AF29520450）；拉帕替尼（≥98%）、阿司匹林（≥99%）（北京謹明生物科技有限公司，批號：CSD18L15150G、C19PA44825A）；TBTU[≥99%，吉爾生化（上海）有限公司，批號：GLS140530-00705]；三乙胺（≥99%，阿拉丁（上海）生化科技股份有限公司，批號：F2002079）；CCK-8（恩晶生物科技有限公司，批號：EG20220915）；β-actin、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、HER2、Akt1、p-Akt1-Ser1-24、p-Akt1-Ser169、mTOR、p-mTOR 和HRP-羊 抗兔IgG 抗體（博士德生物工程有限公司，批號：XA517-1BP11766、BST17124009、BST1704094、BST-17514390、BST19264762、BST17084744、BST17064182、BST177-14840、BST17H08A17H54）；AMPK、p-AMPK抗體（愛博泰克生物科技有限公司，批號：5500006292、216013008）；RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：031020200604、092721220221）；ECL 超敏發光液（新賽美生物科技有限公司，批號：ECL-001）。人乳腺癌細胞BT474（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 CompdⅠ的合成

0℃氮氣保護下，拉帕替尼（76 mg，0.13 mmol，1.3 equiv）、阿司匹林（18 mg，0.1 mmol，1.0 equiv）、TBTU（38.5 g，0.12 mmol，1.1 equiv）于CH2Cl2（10 ml）中充分攪勻，然后加入三乙胺（35 μl，0.25 mmol，2.5 equiv），室溫攪拌過夜，加入NH4Cl 溶液（20 ml）使反應淬滅。室溫下劇烈攪拌20 min，分離有機層，無水Na2SO4干燥，過濾，真空濃縮得粗產物。乙酸乙酯溶解粗產物，依次經0.1 mol/L HCl 溶液（15 ml×3次），飽和NaH CO3（20 ml×2 次）洗滌，干燥，過濾，真空濃縮。殘余物經硅膠（200～300 目）柱層析（洗脫劑：二氯甲烷/甲醇（50∶1）純化得亮黃色固體粉末CompdⅠ55 mg。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8.70（s，1H），8.63（s，1H），8.48（s，1H），7.94（d，J=7.5 Hz，1H），7.88（d，J=6.2 Hz，2H），7.77（d，J=8.6 Hz，1H），7.52（d，J=7.2 Hz，1H），7.37（d，J=11.2 Hz，3H），7.24（t，J=11.1 Hz，2 H），7.00～7.05（m，2H），6.73（s，1H），6.33（s，1H），5.18（s，2H），4.54（s，2H），4.23（s，2H），3.47（s，2H），3.03（s，3H），2.25（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 169.57（s），168.62（s），164.26（s），161.81（s），157.95（s），154.95（s），153.74（s），150.86（s），149.80（s），149.42（s），147.41（s），139.19（d，J=7.4 Hz），132.77（s），131.25（s），130.20（d，J=8.2 Hz），128.95（d，J=10.3 Hz），128.36（s），128.08（s），127.86（s），126.00（s），124.78（s），123.25（s），122.50（s），122.01（s），114.97（dd，J=80.4，59.2 Hz），114.81（s），114.57（d，J=48.4 Hz），114.33（s），114.13（s），113.91（s），112.12（s），107.28（s），70.46（s），51.72（s），46.52（s），41.43（s），39.75（s），29.72（s），21.04（s）；19F NMR（376 MHz，CDCl3）δ -112.62（s）；HRMS（ESI）：m/z for C38H32ClFN4O7S [M+H]+calcd 743.174 4，found 743.174 9。

1.3.2 CompdⅠ抗HER2 陽性乳腺癌細胞BT474 增殖作用

1.3.2.1 CCK-8 實驗 將BT474 細胞（5×103/ 孔）接種于96 孔板，待細胞貼壁后，分別加入CompdⅠ（0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00、4 000.00、8 000.00 nmol/L），拉帕替尼（0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00、4 000.00、8 000.00 nmol/L），阿司匹林（0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0、40.000 0 mmol/L），5%CO2、37℃培養箱孵育24、48、72 h。依據文獻[15]測定并計算其半數抑制濃度（median inhibitory concen tration，IC50）。每組5 個復孔，重復3 次。

1.3.2.2 平板克隆試驗 取對數期細胞（1×103/孔）接種于六孔板中。將細胞分為空白組、阿司匹林組（5 mmol/L）、拉帕替尼組（500 nmol/L）、CompdⅠ（500 nmol/L）組。各組培養48h后更換完全培養基培養21 d，參考文獻[16]觀察并計算克隆形成率。每組重復3次。1.3.2.3 分子對接 使用AutoDock 4.2，將CompdⅠ與PDB 數據庫（https：//www.RCSB PDBus.org/）中獲取的靶蛋白[EGFR、HER2、AMPK、Akt1、mTOR、環氧合酶1（cyclooxygenase 1，COX1）]進行分子對接[17-19]，使用PYMOL 進行可視化。

1.3.2.4 Western blot 將不同藥物處理的BT474 細胞用預冷的RIPA 裂解，BCA 法檢測蛋白質濃度。參考文獻[20-21]上樣，轉膜、封閉，采用兔β-actin，EGFR、HER2、AMPK、p-AMPK、Akt1、p-Akt1-Ser124、p-Akt1-Ser169、mTOR、p-mTOR 抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，并用HRP 標記山羊抗兔IgG 室溫下孵育1 h（1∶7 500）；TBST 洗滌10 min，重復3 次，ECL 發光，分析各蛋白的表達量。Image J 軟件計算灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CompdⅠ的合成

以拉帕替尼和阿司匹林為原料經過縮合反應合成CompdⅠ，產率為78%，熔點為101.7～102.7℃。合成路線見圖1。

圖1 CompdⅠ的合成路線

2.2 CompdⅠ抑制BT474 細胞增殖

不同濃度的CompdⅠ培養24、48、72 h 均能抑制BT474 細胞增殖，見圖2A；培養24、48、72 h，CompdⅠ與拉帕替尼和阿司匹林的IC50比較，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），見表1；與空白組比較，阿司匹林組、拉帕替尼組、CompdⅠ組的克隆形成率更低，與阿司匹林組、拉帕替尼組比較，CompdⅠ組的克隆形成率更低，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2B～C。

表1 阿司匹林、拉帕替尼和CompdⅠ對BT474 細胞的IC50 比較（，n=3）

注 與拉帕替尼組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與阿司匹林組比較，ccP＜0.01。IC50：半數抑制濃度

2.3 CompdⅠ與增殖通路相關靶點結合與驗證

2.3.1 CompdⅠ與增殖通路相關靶點分子對接結果

CompdⅠ與EGFR、HER2、AMPK、Akt1、mTOR 結合能絕對值均≥5 kcal/mol，且與EFGR、Akt1、mTOR對接能較拉帕替尼更低；CompdⅠ與COX1 不能結合，而阿司匹林與COX1 有較低的結合能（-7.054kcal/mol），見表2。以CompdⅠ與EGFR、HER2 結合為例，其對接結果見圖3。

表2 CompdⅠ與EGFR、HER2、AMPK、Akt1、mTOR及COX1 對接的結合能（kcal/mol）

圖3 CompdⅠ、拉帕替尼分別與AMPK/mTOR 增殖通路相關靶點分子對接

2.3.2 CompdⅠ對AMPK/mTOR 通路蛋白的影響

與空白組比較，CompdⅠ組和拉帕替尼組EGFR、HER2、p-Akt1-Ser124、p-Akt1-Ser169、Akt1、p-mTOR及mTOR 下調，阿司匹林組p-Akt1-Ser169、p-mTOR下調，CompdⅠ組p-AMPK 和AMPK 上調，拉帕替尼組AMPK 上調，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。與拉帕替尼組比較，CompdⅠ組p-AMPK 上調，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 CompdⅠ、拉帕替尼和阿司匹林對BT474 細胞中AMPK/mTOR 通路蛋白的影響（n=3）

3 討論

本研究采用拼合原理，通過縮合反應一步合成拉帕替尼和阿司匹林的孿藥[22-23]。初步研究發現，CompdⅠ可以抗BT474 細胞增殖，且較拉帕替尼殺傷作用更強。與拉帕替尼比較，CompdⅠ有更強的激動AMPK，抑制Akt/mTOR 作用。可能因為其既發揮拉帕替尼拮抗HER2/EGFR 作用，同時依賴阿司匹林激活AMPK，抑制mTOR 作用[24]。此外，因阿司匹林對COX 的非選擇性作用，常導致消化系統潰瘍等不良反應[25]，而分子對接顯示CompdⅠ與COX1 沒有結合作用。因此，與阿司匹林、拉帕替尼藥物比較，CompdⅠ的副作用可能更小。同時，CompdⅠ藥物服用更方便，可提高患者的依從性，值得進一步研究。