基于網絡藥理學方法研究知母治療2型糖尿病作用機制

詹志敏，付萬進，胡偉

作者單位：1合肥新橋國際機場有限公司急救站，安徽 合肥 230086；

2安徽醫科大學第二附屬醫院藥物臨床試驗研究中心，安徽 合肥 230022

隨著社會經濟的發展和人民生活質量的提高，T2DM 發病率呈逐年上升趨勢，目前我國已成為全球糖尿病病人最多的國家。T2DM 為內分泌科常見疾病，以多飲、多食、多尿、消瘦和乏力為主要臨床癥狀，可導致糖尿病腎病、視網膜病變、周圍神經性病變、心腦血管疾病等并發癥，嚴重危害人類健康，給社會、家庭帶來巨大負擔［1-2］。

中醫認為T2DM 屬于為“消渴癥”范疇，其病機主要在于機體的陰虛燥熱，以陰虛為本，燥熱為標，中藥治療時基本原則以清熱潤燥、養陰生津為主［3-4］。中藥知母為百合科植物知母的干燥后的根、莖，性苦、甘、寒，具有清熱瀉火、滋陰潤燥之功，適用于高熱煩渴，內熱消渴，腸燥便秘之癥，能有效降低T2DM 病人血糖水平，改善臨床癥狀，療效肯定［5-7］。但中藥通過多成分、多靶點協同作用治療疾病，使用現代藥理學研究方法難以系統全面解析中藥治療疾病的作用機制［8］，目前知母治療T2DM 的具體作用機制尚未明確，限制其進一步開發利用。

網絡藥理學是由藥理學、生物信息學及計算機學的融合而發展起來的一門學科，主要通過大數據挖掘中藥化學成分用于構建中藥化學成分數據庫；使用機器學習方法預測化合物和靶點之間作用關系；通過疾病相關數據庫和文獻的挖掘方法獲得疾病相關靶點；將藥物化學成分預測靶點與疾病靶點進行關聯獲得藥物治療疾病靶點；將上述信息抽象為網絡關系模型后可以解釋中藥治療疾病作用機制［9］。本研究利用網絡藥理在研究多成分和多靶點方面的優勢，研究知母治療T2DM 的主要機制，并為知母在臨床應用提供證據，其研究方法流程見圖1。

圖1 基于網絡藥理學的方法研究知母治療T2DM作用機制流程圖

1 資料與方法

1.1 數據準備

1.1.1 知母化學成分數據庫建立通過中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）挖掘中藥知母中每個化學成分及其對應的化學性質參數，將得到的數據用于組建知母的化學成分數據庫。

1.1.2 ADME 模型篩選知母活性分子體外ADME模型（吸收，分布，代謝和排泄）主要利用體外實驗與數學建模方法研究藥物在體內吸收代謝情況，該方法較以往基于動物實驗方法研究藥物體內吸收過程效率更高、成本更低，可用于大規模預測化學分子的藥代動力學參數［10］。本次研究利用體外AD?ME 模型中的口服生物利用度（oralbioavailability，OB），半衰期（half-life，HL）和類藥性（drug-like，DL）三個指標篩選知母中的潛在活性分子。OB 指藥物經口服吸收后進入人體循環系統的能力，化合物OB指標值的大小與合物在體內吸收率呈正相關，本研究篩選了OB 指標值大于0.3 的化合物作為潛在的活性分子［11］。通過計算化學分子與已被批準上市藥物結構之間的相似性來計算化學分子的類藥性，DL 指標值大小與化合物成藥可能性呈正比。DL 指標在藥物的前期開發中促進高活性化合物篩中率，提高藥物的開效率，本研究通過篩選化學分子的DL值大于0.18 作為潛在的活性分子［12］。半衰期指標化合物的血液濃度降低一半所需的時間，本研究篩選化合物半衰期指標值大于3 h 作為潛在的活性成分。

1.1.3 化合物作用靶點預測將ADME 模型篩選獲的活性分子在TCMSP 數據庫中挖掘其作用的靶點。該數據庫通過隨機森林和支持向量機（SVM）機器學習方法建模預測化合物作用靶點模型。隨機森林和 SVM 模型性能對于化合物作用靶點預測具有較高的可靠性和魯棒性，模型的平均準確率82.83%、召回率 81.33%、查準率 93.62%［13］。

1.1.4 疾病靶點挖掘在Uniprot、遺傳關系數據庫（GAD）和人類孟德爾遺傳疾病數據庫（OMIM）3 個人類疾病靶點數據庫系統上使用“Diabetes mellitus type 2”和“Type 2 diabetes mellitus”2 個關鍵詞、物種選擇上使用“homo species”方法來挖掘與T2DM 相關的靶點，將獲得靶點使用Venny 2.1系統取交集獲得與T2DM相關的靶點集［14］。

1.1.5 T2DM 相關靶點蛋白相互作用（PPI）數據挖掘使用bisogenet 3.0 插件挖掘T2DM 中相關靶點蛋白之間相互作用關系，bisogenet 3.0插件通過整合6 個生物學數據庫中的靶點間的作用關系，可較全面獲得的疾病靶點的蛋白-蛋白相互作用數據［15］。本研究將bisogenet 3.0插件獲得蛋白-蛋白作用關系使用Cytoscape 軟件構建T2DM 靶點的蛋白-蛋白（PPI）相互作用網絡，為更加簡潔展示PPI 作用關系網絡構建時刪除無相互作用節點和節點自身相互作用的邊和度值小于3的節點［16-17］。

1.2 富集分析將C-D網絡中的蛋白靶點導入DA?VID 6.8 系統中，使用Fisher 精確檢驗方法進行KEGG 通路富集分析，排除與T2DM 疾病不相關通路，篩選出P<0.01 的通路進行分析，并構建C-D-M網絡。

1.3 網絡構建本研究使用Cytoscape 3.6.0 軟構建了以下4 種網絡：T2DM 疾病靶點蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡、藥物分子-靶點（C-T）網絡、藥物分子-疾病靶點（C-D）網絡和藥物分子-疾病靶點-通路（CD-M）網絡。

1.4 分子對接在中藥系統藥理學數據庫中下載格式為“.mol2”化合物對應分子結構，使用Discovery Studio 軟件對化合物結構進行優化，使用AutoDock軟件中prepare_ligand4腳本將“.mol2”格式分子轉化為“.pbdqt”格式文件。

在Uniport 中檢索GSK-3β 蛋白結構，并下載“PDB”格式的蛋白分子，使用Discovery Studio 軟件去除蛋白中的水分子和配體化合物，再使用Discov?ery Studio 軟件對蛋白分子進行結構優化，使用AutoDock 軟件中prepare_receptor4 腳本將“PDB”蛋白結構加氫并轉化為“.pdbqt”格式文件，最后使用AutoDock 軟件對蛋白對接盒子的空間坐標進行確定。

使用AutoDock Vina 軟件將處理好的小分子與蛋白文件進行批量分子對接。每個小分子化合物與蛋白對接后產生20個構象，本次研究選擇能量最低的構象進行展示，其中蛋白與分子相互作用的三維結構使用Pymol 軟件制作，二維結構圖使用Dis?covery Studio軟件制作。

2 結果

2.1 藥物化合物-靶點網絡分析

2.1.1 知母成分數據庫構建知母通過數據庫挖掘獲得81 個化學分子，將81 個分子的化學性質參數信息用于構建知母成分數據庫。知母化學成分數據庫中的化學分子根據成分性質可分為雙苯吡酮類、皂苷類、甾醇類、木質素類、生物堿、多糖類化合物。

2.1.2 ADME 篩選活性分子使用ADME 模型指標篩選活性分子，其中OB 指標篩選出28種化學分子，半衰期指標篩選出27 個化合物，DL 指標值篩選出48種化學分子，篩選結果見圖2，對ADME 模型各個指標篩選活性分子使用Venny 2.1 系統取交集得到15個活性分子，知母活性化合物詳細信息見表1。

圖2 ADME活性分子篩選

表1 知母活性成分篩選結果

2.1.3 知母藥物化合物和靶點網絡知母活性分子作用靶點（C-T）網絡一共包括129 個節點和250個邊，見圖3。該網絡由15 個活性分子節點和114個蛋白靶點節點組成，其中活性分子節點與靶點節點間有250 個作用關系。不同節點在C-T 網絡的重要程度并不相同，不同的化學分子作用靶點數量并不均衡，如山奈酚分子作用72 個潛在靶點，分子豆甾醇作用43 個靶點，而淫羊藿苷Ⅰ、菊花黃素和知母皂苷E_qt 其僅影響1 個蛋白靶點。同樣的，一些蛋白靶點可被多種化合物協同作用，一些靶點僅受很少化合物的作用。例如，ERS1 靶標被12 種化合物調節，知母中11種化學分子調節AR蛋白靶點，但是一些靶點如TP3、TNF 靶點僅受一個分子的調節。知母C-T網絡不同節點重要程度不相同說明知母在治療T2DM可能由關鍵化合物起重要作用。

圖3 知母活性分子作用靶點網絡：綠色圓形表示靶點，黃色三角形表示知母活性分子

2.2 T2DM 相關的靶點挖掘本研究從Uniprot 中獲得288 個、從OMIM 獲得183 個、從GAD 獲得356個與T2DM 相關靶點蛋白，將上述結果取交集獲得730個T2DM相關靶點蛋白，結果見圖4。

圖4 T2DM相關的靶點蛋白

2.3 T2DM 蛋白質-蛋白質相互作用網絡將730個T2DM 相關的靶點蛋白置入bisogenet 3.0 插件中獲得蛋白之間相互作用數據后，刪除網絡中沒有相互作用節點和自相作用節點的邊，再使用Cytoscape軟件重新構建T2DM靶點蛋白PPI網絡，并刪除度值小于3 的節點，結果見圖5，該網絡由230 個節點和777 作用關系構成。PPI 網絡圖中節點“度值”越大說明節點在網絡中與其他節點連接程度越高，在T2DM 的PPI 網絡中NTRK1、TP53、ESR1、ATK1、STAT3、SMAD3靶點的“度值”較高，對應的度分別為78、44、32、30、26、24，說明這些靶點在網絡中重要程度越高，這些靶點在T2DM 的發展中可能起重要作用。

圖5 T2DM相關的靶點PPI網絡

2.4 知母-T2DM 靶點網絡使用Cytoscape 軟件中的Merge 工具對知母C-T 網絡、T2DM 的PPI 網絡取交集，獲得知母分子-T2DM 靶點（C-D）網絡。知母-T2DM 靶點網絡中分子作用靶點詳細信息見表2。該網絡由33 個節點和76 個邊構成，其中含有13 個知母活性分子，20個T2DM靶點蛋白，見圖6。

圖6 知母活性分子-T2DM靶點網絡

表2 知母-T2DM靶點網絡中分子作用靶點詳細信息

2.5 知母活性分子作用T2DM 靶點-通路網絡為研究知母治療T2DM 主要作用通路，本研究將知母活C-D網絡中的T2DM 靶點蛋白置入DAVID 數據庫中進行KEGG 富集分析，將富集結果中特殊疾病信號通路刪除，保留P值最小10 個通路，再利用Cyto?scape 軟件將上述結果構建知母活性分子-T2DM 靶點-通路（C-D-M）網絡，結果見圖7和圖8。C-D-M 網絡由43個節點和133個邊組成，該網絡包含13個知母中的化合物和20個T2DM靶點和10個通路。

圖7 知母活性分子-T2DM靶點-通路網絡圖

圖8 知母活性分子-T2DM靶點-通路氣泡圖

從C-D-M 網絡可知母中活性分子作用的8 個蛋白靶點富集到胰島素抵抗通路，7 個蛋白靶點富集到PI3K-Akt 信號通路，6 個蛋白靶點富集到流體剪切應力和動脈粥樣硬化、糖尿病性心肌病和胰島素信號通路，5 個蛋白靶點富集到AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發癥中的作用、HIF-1 信號通路、AMPK信號通路和甲狀腺激素信號通路，4個蛋白靶點富集到2型糖尿病通路上，詳細信息見表3。

表3 知母治療T2DM富集通路信息

2.6 分子對接結果使用AutoDock Vina 分子對接結果提示MOL000631、MOL000422、MOL004373、MOL004497 與糖原合成酶激酶（GSK-3β）有明顯相互 作 用 關 系 ， MOL000631、 MOL000422、MOL004373、MOL004497 與GSK-3β 對接后最穩定構象的能量分別為?8.3、?7.3、?8.0 和?7.6 kcal/mol，結果見表4。

由分子對接的三維結構圖可知，對接后MOL000631、MOL000422、MOL004373、MOL004497分子最穩定的構象在GSK-3β 表面空隙或表面溝壑空隙中。由分子對接二維結構圖可知，MOL000631分子可以與GSK-3β 第338 位絲氨酸殘基產生一個氫鍵；MOL000422分子可以與GSK-3β第336位丙氨酸殘基產生一個氫鍵；MOL004373分子可以與GSK-3β 第341 位天冬氨酸殘基產生一個氫鍵相互作用；MOL004497分子可以與GSK-3β第89位谷氨酰胺殘基、第94 位的賴氨酸殘基、第95 位的天冬酰胺殘基和第96位精氨酸殘基分別產生一個氫鍵相互作用，見圖9。

圖9 知母活性分子與糖原合成酶激酶對接后對接結構圖

3 討論

糖尿病以高血糖為特征的代謝性疾病，長期高血糖可導致機體的心血管、消化、神經等組織出現并發癥，其發病機制與胰島素通路、免疫反應、抗炎反應氧化應激等反應有關［18-19］。本研究發現知母通過多成分、多靶、多通路協同效應用于T2DM治療。

在C-D 網絡中有13 個知母分子調控20 個T2DM 疾病相關靶點來用于糖尿病的治療。其中糖原合成酶激酶（GSK-3β）在C-D網絡的可被4個知母活性分子調節。GSK-3β 酶在肝臟的葡萄糖代謝中起著重要作用，GSK-3β可通過磷酸化糖原合成酶可抑制其酶活性，抑制肝臟糖原的合成，使機體的血糖升高，在糖尿病病人體內GSK-3β 表達量較正常人高30%、其酶的活性高一倍［20］，分子對接提示4 個知母活性分子可與GSK-3β 產生氫鍵相互作用。糖尿病血管病變是糖尿病導致后遺癥產生的主要原因，血管病變與機體炎癥的氧化應激有著密切關系，體內一氧化氮（NO）可以明顯降低體內的炎癥、氧化應激反應。內皮型一氧化氮合成酶（NOS3）作用底物是精氨酸，可將精氨酸轉化為瓜氨酸或者是N-羥基精氨酸，并進一步代謝合成NO，NO促進葡萄糖轉運至細胞內；NO 也可減緩胰島β 細胞損傷，保護胰島β細胞功能，加速細胞對葡萄糖的攝取，促進細胞內的脂代謝增強，研究發現糖尿病病人體內NO 含量較正常人組明顯降低［21-22］，本研究發現知母活性分子可以調節NOS3信號通路。

通過分析C-D-M 網絡發現，知母可通過調節8個靶點調控胰島素抵抗通路，胰島素抵抗是指靶細胞對胰島素的代謝反應降低、或在整個機體水平上、循環或注射胰島素對血糖的降低作用受損。機體主要在外周組織（肌肉和脂肪）和肝臟組織出現胰島素抵抗。體內胰島素在外周組織可促進葡萄糖吸收或儲存，在肝臟組織抑制肝臟的葡萄糖輸出從而達到降低血糖的水平，胰島素抵抗是導致機體出現糖尿病主要原因［23］。

PI3K/AKT信號通路不但在細胞的分裂、分化和凋亡中起著重要的作用，也在糖類合成轉運和代謝、蛋白質合成以及脂肪代謝途徑起著重要作用［24］。知母活性分子通過調控7 個靶點作用于PI3K/AKT 信號通路。胰島素作用于細胞膜表面的胰島素受體后主要通PI3K/AKT 通路及MAPK 通路發揮功能、其中，PI3K/AKT 通路在控制體內營養平衡和器官存活方面起著重要的作。胰島素在PI3K/AKT 通路中通過上調PI3K 和Akt 分子水平，啟動PI3K-Akt 信號通路的傳導，活化的下游分子增加細胞內糖原的生成，抑制糖異生反應，最終起著降低機體血糖水平［25］。

AMPK 信號通路是生物能量代謝調節的關鍵通路，在調節機體能量代謝、調控細胞內能量平衡方面起著重要作用［26］。知母活性分子通過調控5個靶點作用于AMPK 信號通路。AMPK 蛋白可通過調控下游多個效應因子影響糖類代謝以及氧化應激反應等多種生理過程，保護胰島β細胞，抑制胰島素抵抗的發生，從而用于T2DM疾病的治療［27］。

HIF-1 信號主要參與細胞對氧含量的變化的反應，尤其是對氧氣的減少或缺氧作出反應，激活HIF-1 信號可促紅細胞生成、葡萄糖轉運、糖酵解酶、血管內皮生長因子和其他基因蛋白物質增加氧的輸送或促進缺氧能量代謝［28］。本研究發現知母活性分子調控5個蛋白靶點作用于HIF-1信號通路。長期血糖升高導致糖化血紅蛋白在紅細胞中的上升、紅細胞攜氧量下降，導致機體細胞處于缺氧環境，而低氧環境可激活HIF-1 信號促進40 多種蛋白表達增加機體對缺氧環境適應性。但長期血糖水平升高會降低HIF-1α蛋白表達，導致機體缺氧對缺氧適應性降低；嚴重持續缺氧可導致HIF-1α表達水平下降，HIF-1α 表達水平下降是高血糖導致組織發生周圍神經病變及糖尿病疾病進展的重要因素［29］。

從C-D-M 網絡中通路節點發現知母也可通過流體剪切應力和動脈粥樣硬化、糖尿病性心肌病和胰島素信號通路、AGE-RAGE 信號通路及甲狀腺激素信號等通路上用于T2DM治療。

4 結論

綜上所述，本研究通過使用網絡藥理學方法研究知母治療T2DM 作用機制，對中藥藥理作用機制的探索提供了一定的參考價值，提示知母中的活性分子可通過調節調控胰島素通路、胰島素抵抗通路、PI3K-Akt 信號、調控NO 合成，調控缺氧信號通路、調控能量代謝等途徑用于T2DM 的治療，揭示了知母治療T2DM 的臨床治療潛力。但是，本研究主要利用生物信息學數據庫信息和算法對知母對T2DM 作用機制進行預測研究，研究過程中尚未考慮到藥物質量、劑量、劑型等因素的影響，因此后期還需采用體內試驗研究方法逐步驗證預測結果可靠性。

（本文圖1~5見插圖8-5，圖6~9見插圖8-6）