基于網絡藥理學探討二白膏治療慢性濕疹的作用機制

王羽儂，馮蕙裳，王瑩，王家悅，李元文，張豐川

作者單位：1北京中醫藥大學東方醫院皮膚科，北京 100029；

2北京中醫藥大學第三附屬醫院皮膚科，北京 100029；

3北京中醫藥大學東直門醫院皮膚科，北京 100027

慢性濕疹常由急性及亞急性濕疹遷延不愈而成，常表現為患部皮膚肥厚粗糙，呈苔蘚樣變、鱗屑及皸裂，瘙癢程度輕重不一，病情遷延反復數月或數年。多發于手足、軀干四肢間擦部位及外陰、肛門等處，以四肢多見，常對稱分布。慢性濕疹病人無法忍受癥狀反復發作，嚴重影響其正常生活和工作，無論生理還是心理都遭受長期折磨［1］。目前外用藥治療中，糖皮質激素藥膏應用最為廣泛，但存在長期應用耐藥、激素依賴等問題；中醫外治常采用多種中藥外洗及中成藥軟膏涂抹［2］。慢性濕疹屬于中醫“濕瘡，血虛風燥證”范疇，治療以活血祛風，潤燥止癢為原則。

二白膏為導師張豐川教授經驗方，由白及粉、三七粉組成，用時取適量加凡士林調和成膏涂抹患處，具有潤燥生肌、養血活血、收斂止癢的功效。張教授多年在臨床中用其治療身體各部位慢性濕疹，改善皮膚粗糙肥厚、皸裂及瘙癢療效甚佳，且使用方便易攜帶，病人依從性好。本研究在2019年的臨床研究基礎上，于2022 年1―5 月開展網絡藥理學研究，從藥物活性成分出發，多角度、多層次聯系“藥物-疾病-基因”相互作用靶點及相關作用通路，探討二白膏多靶點整合調節慢性濕疹的作用機制，進而驗證其臨床療效。

1 材料與方法

1.1 復方二白膏活性成分的篩選及靶點預測利用中藥系統藥理學平臺（TCMSP）搜集白及、三七化學成分，將類藥性≥0.18 和脂水分配系數<0.5 作為機體對外源化學物的吸收、分布、代謝和排泄（ab?sorption，distribution，metabolism，and excretion，AD?ME）性質參數以預測以上單味藥的有效成分。為避免個別認可度較高的有效成分被篩選掉，故同時查閱《中國藥典（2015 版）》與CNKI 中相關文獻，得到此類成分并合并至TCMSP 數據庫篩選結果。通過SwissTargerPrediction 網站（http：//www. swisstarget?prediction.ch/）進行靶點預測［3］。

1.2 慢性濕疹靶點預測在人類在線孟德爾遺傳平臺（OMIM，https：//www.omim.org/）和人類基因數據庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）輸入關鍵詞“chronic eczema”獲取慢性濕疹的靶點。

1.3 成分疾病共有靶點的獲取及蛋白-蛋白互作網絡的構建將二白膏靶點與慢性濕疹靶點通過Draw Venn Diagrams 網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，得到成分疾病共有靶點。將共有靶點導入String網站（https：//string-db.org/）繪制蛋白-蛋白互作網絡圖（protein-protein in?teraction，PPI），并利用Cytoscape 3.9.1軟件對蛋白網絡結構進行可視化處理及拓撲特征分析，以“節點度中心性”（degree centrality，DC）、“中介中心性”（betweenness centrality，BC）及“接近中心性”（close?ness centrality，CC）3 個參數的中位數作為篩選條件，篩選2次得到成分治療疾病的核心靶點。

1.4 GO 分析和KEGG 富集分析基因本體論GO分析是一種可以通過生物途徑對基因進行說明與注釋的富集分析方法。京都基因與基因組百科全書通路分析可對篩選靶標參與的通路進行富集分析。本研究將成分對疾病的直接作用靶點導入DA?VID 網站（https：//david.ncifcrf.gov/），進行GO 和KEGG分析。

1.5 網絡構建將二白膏藥物、有效成分、靶點及作用通路導入Cytoscape 3.9.1 軟件，建立“藥物-成分-靶點-通路”網絡。

1.6 分子對接分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設計的方法。主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法。本研究基于在線CB-Dock 網站（http：//cao.labshare.cn/）進行分子對接驗證［4］；通過蛋白質晶體結構數據庫PDB（https：//www.rcsb.org/）得到核心靶點的3D 晶體結構，TCMSP 網站得到成分的mol2 結構，同時將活性成分的mol2結構和靶點的PDB 文件導入CB-Dock網站，進行分子對接。

2 結果

2.1 二白膏化學成分篩選與靶點預測從TCMSP數據庫搜索二白膏各味藥的化學成分，白及36 種，三七119 種；根據其中“類藥性≥0.18 和脂水分配系數<0.5”條件，選定17 種成分作為活性成分，其中白及9 種，三七8 種，另從藥典及相關文獻［5-6］驗證指標性成分。

將活性成分通過SwissTargetPrediction 數據庫進行的靶點預測，去除重復項后共得到626 個成分靶點。

2.2 慢性濕疹靶點以“chronic eczema”為關鍵詞在OMIM 和GeneGards 數據庫中分別找到2 342 和2 421個疾病靶點，篩選、合并去除重復項后，共得到689種疾病靶點。

2.3 藥物成分與疾病靶點映射結果及PPI 網絡的構建通過Draw Venn Diagrams 網站，得到97 個共有靶點，如圖1所示。

圖1 二白膏靶點和慢性濕疹靶點的韋恩圖

String 網站是一個功能蛋白關聯網絡，可以預測蛋白質與蛋白質之間的相互作用。將所有靶點導入網站后，得到PPI 網絡圖，其中一個靶點被String網站自動刪除，保存為TSV格式后，并利用Cy?toscape 3.9.1 軟件對蛋白網絡結構進行拓撲特征分析，篩選成分治療疾病的核心靶點，如圖2，表1 所示；將構建的PPI網絡進行可視化處理，如圖3所示。將15 個核心靶點排序后，SRC（度值=60）、ESR1（度值=42）、MMP9（度值=44）、AKT1（度值=67）、EGFR（度值=58）是該網絡中的關鍵靶點。

圖2 PPI網絡的拓撲篩選過程

圖3 二白膏中97個靶點的PPI網絡圖

表1 二白膏治療慢性濕疹的15個核心靶點信息

2.4 GO 分析及KEGG 富集分析利用DAVID 網站對97 個靶點進行富集分析。以FDR<0.05 為篩選條件，得到GO 生物學條目146 條，主要涉及細胞信號傳導（細胞增殖、細胞遷移、細胞凋亡等）、炎癥反應、免疫反應等方面，根據FDR 值排序后，排名前10的生物過程如圖4所示。由此推測二白膏治療慢性濕疹可能是一個復雜的多途徑協同作用的結果。

圖4 97個靶點的GO富集分析

為了進一步揭示二白膏治療慢性濕疹的作用機制，我們對97 個靶點進行KEGG 通路分析，根據FDR<0.05 及慢性濕疹相關信號通路篩選出18 條相關途徑，分析結果如圖5所示，可以發現這些基因數目主要在PI3K-Akt 信號通（hsa04151）（見圖6）、JAK-STAT 信號通路（hsa04630）、TNF 信號通路（hsa04668）、MAPK信號通路（04010）等相關通路。

圖5 97個靶點的KEGG通路分析

圖6 KEGG通路圖（PI3K）

2.5 “藥物-成分-靶點-通路”網絡的構建為了更好地闡明藥物、成分、靶點和通路之間的關系，我們使用Cytoscape 3.9.1 構建了“藥物-成分-靶點”網絡（圖7A）及靶點-通路網絡（圖7B）。通過該網絡，我們可以直觀地展示二白膏治療慢性濕疹的有效物質及其可能的作用機制。

圖7 藥物-成分-靶點-通路網絡圖：A為藥物-成分-靶點網絡圖(綠色節點代表藥物，黃色節點代表成分，藍色節點代表靶點)；B為靶點-通路網絡圖(紅色節點代表核心靶點，黃色節點代表核心靶點外的靶點，藍色節點代表通路)

2.6 分子對接驗證根據PPI 網絡及拓撲學分析，選擇“度”排名前5 的靶點SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）、ESR1（雌激素受體α）、MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）、AKT1（絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶1）、EGFR（表皮生長因子受體）；通過構建核心靶點-成分網絡（圖8），選擇對應核心靶點數最多的前4個化合物ginsenoside f2（人參皂苷F2）、3-（p-hydroxyben?zyl）-4-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene［3-（對-羥芐基）-4-甲氧基-9，10-二氫菲］、DFV（二羥基黃烷酮）、Diop（鄰苯二甲酸二異辛酯）做進一步分析。基于在線對接網站，將5 個靶蛋白與4 個活性成分分別進行對接，結果見表2。表2中受體和配體進行分子對接所得到復合物的得分越低，代表受體和配體親和力越高。20 種對接方法均顯示較好的對接活性，表明二白膏的活性成分可能通過與SRC、ESR1、MMP9、AKT1、EGFR 等活性靶點作用，發揮治療慢性濕疹的作用。

圖8 核心靶點-成分網絡：圖左節點代表核心靶點，圖右節點代表成分

表2 二白膏治療慢性濕疹的成分與靶點的結合能/（kJ/mol)

3 討論

濕疹屬中醫“濕瘡”范疇，常反復發作，瘙癢劇烈［7］。中醫認為濕邪郁久耗傷氣陰，局部血虛津虧，肌膚失養，故皮膚干燥粗糙、肥厚乃至皸裂。西醫認為本病與免疫、遺傳、過敏原、皮膚屏障功能障礙等因素有關，局部治療多采用糖皮質激素［8-9］。但局部外用藥物治療存在潛在的不良反應，如誘發感染、皮膚燒灼感、皮膚萎縮、毛細血管擴張等，且易形成激素依賴，停藥后癥狀反復［10］。

二白膏為張豐川教授治療慢性濕疹局部外用藥多年經驗方，臨床應用療效確切。白及、三七均為植物藥，無毒性，無特殊氣味，顏色較淺，對皮膚美觀無礙，且幾乎無不良反應，方便病人自行調配及隨身攜帶，病人依從性好。《唐本草》載白及“手足皸拆，嚼以涂之”，言其因味澀收斂，能生肌斂瘡，治療手足皸裂、肛裂等收效甚佳。現代研究表明其可縮短凝血時間及抑制纖溶，具有良好的局部止血作用，能形成人工血栓而止血［11］。其根中含白及甘露聚糖，具抗潰瘍活性［12］。體外實驗表明白及對多種細菌及真菌有一定抑制作用［13］。還可以通過提高細胞外角質膠原水平、傷口巨噬細胞數量以抵御氧化、幫助皮膚生成皮膚保護膜［14］，可謂是卓越的藥用輔料，可見治療慢性濕疹大有裨益。三七“能治一切血病”，具有養血止血、補血散瘀、活血定痛的功效。現代藥理學研究認為三七中主要含有皂苷類、三七素、三七氨酸等成分［15］，具有活血、止血、促造血；抗氧化、促進成纖維細胞和膠原合成、改善皮膚組織結構；抗組胺、增強皮膚免疫力、抗炎等作用［16-17］。可見二白膏對過敏性炎癥性皮膚病有較好的抗過敏抗炎作用，減輕慢性濕疹。

本研究進行了二白膏中有效成分與靶點相互作用網絡拓撲篩選、PPI 網絡的構建與分析、GO 富集分析和 KEGG 通路分析等。從藥物-成分-靶點網絡圖可以看出，二白膏的關鍵化合物主要集中在人參皂苷F2、二氫菲類化合物、食脂素、鄰苯二甲酸二異辛酯，其中人參皂苷F2 表現了高強度的活性，主要存在于三七中。多項研究表明，人參皂苷F2作為具有抗氧化應激作用的天然產物，可通過一系列信號通路發揮抑制細胞凋亡作用［18］，且被證實具有良好的抗菌、抗炎活性［19］，可通過增加IL-10和Tregs的表達，降低IL-17和Th17細胞的表達來減輕炎癥［20］。二氫菲類化合物可有效地抑制炎性因子的產生，有抗病原菌［21］、解痙、抗血小板凝集、抗過敏等生物活性［22］。三七中的食脂素、鄰苯二甲酸二異辛酯在抗腫瘤、抗衰老、增強人體免疫力等方面發揮了重要的藥理活性［23-24］。從基因蛋白分子層面，二白膏的分子作用靶點中有15個與慢性濕疹關的核心靶點，這15 個靶點進行 PPI 網絡分析，可以發現主要分為細胞因子和蛋白激酶。細胞因子中AKT1、SRC、EG?FR、VEGFA、STAT3等體現了高度的協同作用，也是二白膏治療慢性濕疹發揮藥理作用的主要作用靶點。AKT1 是核降解的重要因子，參與了濕疹模型中角化不全病理中的角質細胞終末分化和角質化包膜形成的關鍵過程［25］。SRC 是重要的抗炎因子，有體外實驗證實某種中藥成分在NF-κB 信號通路中通過作用于SRC 而發揮抗炎作用［26］。外國學者Su 等［27］研究發現基因多態性和基因間相互作用，證明EGFR、SRC 和STAT3 作為轉錄因子或復合物發揮作用，介導基因轉錄和激活，并與腫瘤生長、腫瘤血管生成、胚胎植入和抗磷脂綜合征相關，能通過調節多種炎癥相關細胞因子參與免疫反應。故筆者從分子層面猜測，二白膏通過抗炎、修復皮膚組織，調控皮膚角化來治療慢性濕疹。從功能作用層面，GO 富集分析得到的條目中，主要涉及增強細胞增殖及遷移、抑制細胞凋亡、增加蛋白激酶活性、細胞表面黏附復合物、炎癥反應、信號傳導等多種生物過程，可作為二白膏治療慢性濕疹的關鍵過程。KEGG 通路富集分析篩選得到18 條信號通路，基因數目在P13-Akt 及JAK-STAT 通路上富集較多。其中PI3K-Akt 信號通路可被多種類型的細胞刺激或毒性損傷激活，調節細胞的基本功能，如轉錄、翻譯、增殖、生長和存活。已有大量證據表明，AKT 一旦被激活，可以通過磷酸化參與細胞凋亡、蛋白質合成、代謝和細胞周期的底物來控制關鍵的細胞過程［28］。且AKT1 缺失的小鼠可顯著抑制微血管通透性和白細胞向炎癥部位的募集，使得過敏反應明顯減輕［29］，與本文中最主要的核心靶點作用機制相佐證。根據我們的研究結果，通過抑制AKT1 從而降低 PI3K -Akt 信號通路可能在二白膏活性成分治療慢性濕疹中發揮至關重要的作用。此外，抑制JAKSTAT 信號通路可降低炎癥，改善細胞穩態［30］，且有研究證實糖皮質激素正是通過抑制本文核心靶點中的IL-2 所誘導的JAK-STAT 通路來發揮其強效抗炎作用［31］。可見二白膏的藥理作用與糖皮質激素有異曲同工之妙，且使用安全，不具有其可能產生的不良反應。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對二白膏治療慢性濕疹的作用機制進行了探究，證明為多成分、多靶點、多途徑的復雜網絡協同作用的結果，可以推測二白膏通過抗炎、抗氧化、調控細胞增殖和凋亡、修復皮膚屏障等作用來治療慢性濕疹，臨床應用前景廣闊。

（本文圖1~6見插圖8-2，圖7，8見插圖8-3）