基于抗炎有效成分畬藥樹參莖質(zhì)量標準的研究*

陳張金，余 樂，劉 敏，張曉芹，范 蕾，陳 夢，黃繩武，李建良，陳琴鳴，陳桂云

（1.麗水市質(zhì)量檢驗檢測研究院，浙江 麗水 323000；2.麗水市中醫(yī)院，浙江 麗水 323000；3.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

樹參[Dendropanax dentiger (Harms) Merr.]為五加科樹參屬樹參的灌木或喬木，用藥歷史悠久，被載錄《中華本草》《中藥大辭典》《全國中草藥匯編》《中國畬族醫(yī)藥學》等書籍中，具有祛風除濕、活血消腫的功效，可用于治療風濕病、關(guān)節(jié)炎、半身不遂等疾病，是我國江西和浙江一帶使用頻率較高的30種畬藥之一[1-3]。樹參的藥用部位包括根、莖，其中樹參莖曾作為醫(yī)院制劑“楓荷梨”的君藥被廣泛應用于臨床，療效顯著。但因飲片質(zhì)量標準的缺失，“楓荷梨”制劑已停產(chǎn)，樹參的臨床應用受到限制。課題組在前期基于譜效關(guān)系對樹參莖的抗炎藥效成分開展了研究，結(jié)果表明樹參莖中主要含有酚酸類、黃酮類、苯丙素類化合物[4]，其抗炎的作用是化學成分群共同作用的結(jié)果，其中異綠原酸C、綠原酸、紫丁香苷、異綠原酸A是樹參莖抗炎的主要藥效成分。研究表明，紫丁香苷等苯丙素類成分除具有抗炎活性外，還可抑制脂多糖（LPS）誘發(fā)的炎癥反應[5-6]；綠原酸具有抗佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用，并可通過降低血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）、循環(huán)免疫復合物（CIC）和丙二醛（MDA）含量及提高抗氧化能力發(fā)揮作用[7]；甜葉菊廢渣提取物中的異綠原酸類物質(zhì)具有很好的抗炎效果[8]；綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C在20～100 μm濃度范圍內(nèi)對細胞均無毒性作用，且均有抗炎活性[9]。因此，本研究擬以抗炎有效成分為指標對畬藥樹參莖的鑒別、含量測定方法開展研究，并對水分、總灰分、浸出物進行控制，旨在為該畬藥的開發(fā)應用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀，含DAD檢測器（美國安捷倫公司）；XS105DU型電子天平（瑞士梅特勒公司）；DM2500型正置顯微鏡（德國徠卡公司)；Memmert UNE400型自然對流烘箱（德國Memmert 有限公司）；SK8210HP型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；SXL-1008型程控箱式電爐（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；硅膠H薄層板、硅膠G254薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試劑與試藥 紫丁香苷對照品（批號：DST200912-012，含量：98.54%）、綠原酸對照品（批號：DSTDL002102，含量：99.56%）、異綠原酸A對照品（批號：DSTDY003601，含量：98.56%）、異綠原酸C對照品（批號：DSTDY003802，含量：99.58%）均購自德思特生物技術(shù)有限公司；甲酸、四氫呋喃、乙腈為色譜純；氯仿、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇為分析純；水為超純水。

采集的12批樹參莖樣品經(jīng)李建良副主任中藥師鑒定為五加科樹參屬植物樹參[Dendropanax dentiger (Harms) Merr.]干燥莖。具體信息見表1。

表1 樹參莖樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取過五號篩的供試品粉末，挑取少許置于載玻片上，滴加水合氯醛試液，加熱透化后，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。結(jié)果粉末呈棕黃色；木纖維壁稍厚，孔溝和紋孔較明顯，紋孔為具緣紋孔；木栓組織碎片細胞呈橢圓形，長方形或不規(guī)則形，壁厚，有的含棕色物；草酸鈣簇晶較多，黃棕色，棱角較鈍，直徑10～25 μm；石細胞多成群散在，類方形、卵圓形或多角形，直徑15～30 μm，壁較厚，孔溝細密，胞腔大；導管為具緣紋孔導管，類圓形，紋孔排列緊密；韌皮纖維長條形，末端稍尖或橢圓形，壁厚薄不一，有的胞腔具隔膜，孔溝較深，紋孔可見。（見圖1）

圖1 樹參莖粉末顯微鑒別圖

2.2 薄層鑒別

2.2.1 紫丁香苷[10-12]取過四號篩樹參莖粉末1 g，用60%乙醇25 mL超聲提取1 h，提取液蒸干，用2 mL的乙醇溶解作為供試品溶液。另取紫丁香苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL的紫丁香苷對照品溶液。依照2020年版《中華人民共和國藥典》[13]薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液5～10 μL、紫丁香苷對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（體積比為6.0∶1.2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果顯示供試品色譜在與紫丁香苷對照品色譜相應的位置上，顯相同的亮藍色熒光斑點。（見圖2）

圖2 紫丁香苷薄層色譜鑒別圖

2.2.2 綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C[14-15]取過四號篩的供試品粉末1 g，用60%乙醇25 mL超聲提取1 h，提取液蒸干，用2 mL乙醇溶解作為供試品溶液。另取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對照品，加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合對照品溶液。依照2020年版《中華人民共和國藥典》[13]薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品5～10 μL、混合對照品5 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（體積比為7.0∶2.5∶2.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示供試品色譜在與各對照品色譜相應的位置上，顯相同的亮藍色熒光斑點。（見圖3）

圖3 綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 薄層色譜鑒別圖

2.3 檢查

2.3.1 水分 按2020年版《中華人民共和國藥典》[13]水分測定法第二法（通則0832）檢測，應不得過13.0%。結(jié)果見表2。

表2 樹參莖檢查結(jié)果

2.3.2 總灰分 按2020年版《中華人民共和國藥典》[13]灰分測定法（通則2302）檢測，應不得過5.0%。結(jié)果見表2。

2.3.3 浸出物 按2020年版《中華人民共和國藥典》[13]浸出物測定法（通則2201），以60%乙醇為溶劑，熱浸法檢測，不得少于4.0%。結(jié)果見表2。

2.4 含量測定[4，16]

2.4.1 紫丁香苷、綠原酸[17-19]含量測定

2.4.1.1 色譜條件 以Waters sunfire TM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-混合水溶液（含0.2%甲酸和1.0%四氫呋喃）（7∶93）為流動相，檢測波長為264 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL，流速為1.0 mL/mim，分析時間為30 min。

2.4.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷、綠原酸對照品適量，用50%甲醇稀釋成每1 mL分別含紫丁香苷35.74 μg、綠原酸77.52 μg的混合對照品溶液。

2.4.1.3 供試品溶液的制備 取樹參莖粉末（過四號篩）約2 g，精密加入50 mL 60%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率：500 W，頻率：53 kHz）1 h，放冷后再稱定質(zhì)量，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.1.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取紫丁香苷、綠原酸混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.4.1.1”色譜條件進樣，記錄色譜圖。（見圖4）在該色譜條件下，兩成分與其他成分的色譜峰的分離度均大于1.5，表明分離良好。

圖4 HPLC 圖

2.4.1.5 線性關(guān)系考察 精密稱取紫丁香苷、綠原酸對照品適量至同一25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.178 7、0.387 6 mg/mL的混合對照品溶液Ⅰ。精密吸取混合對照品溶液Ⅰ5 mL至25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液Ⅱ。精密吸取混合對照品溶液Ⅰ1、3、5 μL，混合對照品溶液Ⅱ2、3、5 μL按“2.4.1.1”色譜條件進樣，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得紫丁香苷、綠原酸的回歸方程分別為y=1 829.1x+3.503 2（r=0.999 8）、y=531.13x-5.373 2（r=0.999 8），表明紫丁香苷、綠原酸分別在0.035 7～0.894 0 μg、0.077 5～1.938 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.1.6 精密度試驗 取樹參莖樣品（編號為11）按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，計算紫丁香苷、綠原酸峰面積的RSD分別為0.32%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.7 穩(wěn)定性試驗 取樹參莖樣品（編號為11）按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.4.1.1”色譜條件進樣測定，計算紫丁香苷、綠原酸峰面積的RSD分別為1.99%、0.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.1.8 重復性試驗 精密稱取同一批樹參莖樣品（編號為11）按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.4.1.1”色譜條件進樣測定含量，按干燥品計算紫丁香苷、綠原酸的含量分別為1.00、4.35 mg/g，RSD分別為0.61%、0.58%，表明方法重復性良好。

2.4.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量樹參莖樣品（編號為11）6份，按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密加入紫丁香苷、綠原酸對照品適量，按“2.4.1.1”色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果顯示紫丁香苷、綠原酸的平均加樣回收率分別為98.52%、99.83%，RSD分別為0.57%、0.57%。（見表3）

表3 紫丁香苷、綠原酸加樣回收率試驗結(jié)果

2.4.1.10 樣品含量測定 取不同編號樹參莖樣品，取按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1.1”色譜條件進樣分析，按干燥品計算紫丁香苷、綠原酸含量。（見表4）根據(jù)測定結(jié)果制定限度：按干燥品計，含紫丁香苷應不低于0.010%，含綠原酸應不低于0.075%。

表4 含量測定結(jié)果匯總表

2.4.2 異綠原酸A、異綠原酸C[20-21]含量測定

2.4.2.1 色譜條件 以Waters sunfire TM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-水溶液（含0.2%甲酸和1.0%四氫呋喃）（20∶80）為流動相，檢測波長為328 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL，流速為1.0 mL/mim，分析時間為25 min。

2.4.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，用50%甲醇稀釋成每1 mL分別含異綠原酸A 44.56 μg、異綠原酸C 24.68 μg的混合對照品溶液。

2.4.2.3 供試品溶液的制備 方法同“2.4.1.3”。

2.4.2.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取異綠原酸A、異綠原酸C混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.4.2.1”色譜條件進樣，記錄色譜圖。（見圖5）在該色譜條件下，兩成分與其他成分色譜峰的分離度均大于1.5，表明分離良好。

圖5 HPLC 圖

2.4.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取異綠原酸A、異綠原酸C對照品至同一100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解稀釋成為質(zhì)量濃度分別為0.111 4、0.061 7 mg/mL的混合對照品溶液Ⅰ。精密吸取混合對照品溶液Ⅰ5 mL至25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液Ⅱ。精密吸取混合對照品溶液Ⅰ1、5 μL，混合對照品溶液Ⅱ2、3、5、10 μL按“2.4.2.1”色譜條件進樣，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得異綠原酸A、異綠原酸C 回歸方程分別為y=3 296.4x+0.384 2（r=0.999 9）、y=3 493.8x-13.212 0（r=0.999 9），表明異綠原酸A、異綠原酸C分別在0.022 3～1.114 0 μg、0.012 3～0.617 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2.6 精密度試驗 取樹參莖樣品（編號為11）按“2.4.1.3”項下方法制備的供試品溶液，按“2.4.2.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，計算異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.03%、0.14%，表明儀器精密度良好。

2.4.2.7 穩(wěn)定性試驗 取樹參莖樣品（編號為11）按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.4.2.1”色譜條件進樣測定，計算異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.04%、0.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.2.8 重復性試驗 精密稱取同一批樹參莖樣品（編號為11）按“2.4.1.3”項下方法制備供試品6份，按“2.4.2.1”色譜條件進樣測定含量，按干燥品計算異綠原酸A、異綠原酸C的含量分別為1.67、0.36 mg/g，RSD分別為0.62%、0.93%，表明方法重復性良好。

2.4.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量樹參莖樣品（編號為11）6份，按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密加入異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，按“2.4.2.1”色譜條件進樣測定，計算回收率，結(jié)果顯示異綠原酸A、異綠原酸C的平均加樣回收率分別為98.32%、99.42%，RSD分別為0.86%、0.96%。（見表5）

表5 異綠原酸A、異綠原酸C 加樣回收率試驗結(jié)果

2.4.2.10 樣品含量測定 取不同編號樹參莖樣品，取按“2.4.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2.1”色譜條件進樣分析，按干燥品計算異綠原酸A、異綠原酸C含量。（見表4）根據(jù)測定結(jié)果制定限度：按干燥品計，含異綠原酸A應不低于0.047%，含異綠原酸C應不低于0.020%。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別方法的選擇 在紫丁香苷的薄層色譜鑒別方法中，比較了以下3個展開系統(tǒng)：（1）以氯仿-甲醇-水（6∶3∶1）的下層溶液為展開劑，使用硅膠G板，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，展開晾干后，105 ℃加熱至斑點顯色清晰；（2）以三氯甲烷-甲醇-水（15∶4∶0.2）為展開劑，使用硅膠G板，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，展開晾干后，105 ℃加熱至斑點顯色清晰；（3）以三氯甲烷-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）為展開劑，使用硅膠GF254薄層板，展開晾干后置紫外光燈（254 nm）下檢視。通過比較發(fā)現(xiàn)，第3個展開系統(tǒng)紫丁香苷斑點清晰，與其他成分斑點分離度較好，比移值約為0.6，重現(xiàn)性好，故確定為紫丁香苷的薄層鑒別系統(tǒng)。

3.2 浸出物檢測的意義及方法的選擇 課題組前期分別采用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、正丁醇對樹參莖進行提取，結(jié)果60%乙醇樹參莖提取物的抗炎作用為最佳。由于樹參莖抗炎作用是化學成分群共同作用的結(jié)果，故除含量測定外，制訂樹參莖的醇溶性浸出物檢測方法具有重要的意義。在浸出物方法學研究中，分別考察了不同測定方法（冷浸法、熱浸法）對樹參莖提取物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用60%乙醇采用熱提法的提取率最高，故確定該條件為樹參莖的浸出物檢驗方法。

3.3 含量測定方法的選擇 因紫丁香苷和綠原酸極性較為接近，異綠原酸A和異綠原酸C極性較為接近且和紫丁香苷、綠原酸極性相差較大，故采用了兩個含量測定系統(tǒng)分別測定上述4種成分。研究發(fā)現(xiàn)綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的熱穩(wěn)定性較差，故采用超聲作為樣品的前處理方法。