內蒙古不同產地小秦艽ITS序列比較研究*

劉 倩，黃藝曉，臧二歡，張明旭，李旻輝,2,3

（1.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040；2.內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010020；3.內蒙古自治區中蒙醫藥研究院，內蒙古 呼和浩特 010010）

小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.）又名達烏里龍膽、達烏里秦艽，為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬[Gentiana（Tourn.）L.]植物。其作為藥材秦艽的基原植物收錄于2020年版《中華人民共和國藥典》[1]中。小秦艽根略成紡錘形或圓柱形，長8～20 cm，直徑0.2～1.0 cm；表面棕黃色或棕褐色，有縱向或扭曲的縱溝紋；主根通常為一個或分成數枝[2]。小秦艽具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效，如與石膏、知母、花粉、枳實等配伍，可清熱除煩，潤腸通便[3]，有極高的藥用價值。小秦艽作為蒙醫臨床常用藥，在內蒙古地區分布較廣，但因其種子萌發率低和過度采挖，資源儲備情況不容樂觀[4-6]。目前其正面臨著野生資源急速萎縮、棲息地被破壞、種植地不合理[7]及遺傳多樣性喪失等問題。小秦艽早在1987年被認證為三級國家重點保護野生藥材物種，故加強小秦艽種質資源的研究及保護，以實現資源的可持續開發利用已刻不容緩。

近年來，隨著分子生物學的快速發展，DNA分子標記技術在藥用植物研究領域得到廣泛應用[8-9]，而核糖體DNA的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）是植物類DNA條形碼鑒定的熱門候選序列[10]。ITS由核DNA中nrDNA的18S與5.8S、26S間的兩個基因間區（ITS1、ITS2）組成[11-12]。ITS區不加入成熟核糖體，表現出了極為廣泛的序列多態性[13]，同時其在長度上具有較好的保守性，適合于植物屬、種級的系統發育和分類研究[14]。以ITS區作為分子鑒定手段，研究藥用植物的遺傳進化已有較為成熟的體系[15-16]。裴香萍等[17]通過ITS序列構建系統發育樹對酸棗仁藥材進行鑒定，結果表明不同來源的酸棗仁聚為一支，偽品枳椇子單獨聚為一支，呈現出明顯的單系性，且各正品酸棗仁與偽品枳椇子間的遺傳距離明顯大于酸棗仁各正品之間的遺傳距離。因此，通過ITS序列進行建樹能夠成功鑒別酸棗仁及其偽品枳椇子。邱智敏等[18]通過分析和比較秋茄樹的ITS序列，研究不同引種居群間的遺傳分化和變異情況，揭示秋茄樹的遺傳多樣性水平隨緯度升高而增加，由此可闡明不同地理區域環境對秋茄樹適應性分化的影響。本實驗利用ITS序列分析內蒙古不同產地、不同生長環境的小秦艽樣品的遺傳多樣性，以期對小秦艽種質資源的保護和發展提供一定的參考價值。

1 材料

1.1 小秦艽樣品 采集內蒙古不同產地的野生小秦艽樣品共62份，經內蒙古科技大學包頭醫學院張春紅教授鑒定為龍膽科龍膽屬植物小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.），采集的新鮮樣品經硅膠干燥后保存待測。樣品采集信息見表1。

表1 小秦艽樣品采集地信息

1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（批號：W9909）、TIANSeq高保真PCR反應預混液（NG219）（批號：X0725）、50×TAE Buffer（批號：X0414）均購自天根生化（北京）科技有限公司；GelStain核酸染色劑（10 000×水溶液）（批號：20210702）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；Agarose瓊脂糖（EZ3454B228）購自廣州賽國生物科技有限公司；DL1000 DNA Marker（批號：3591A）購自TaKaRa公司；巰基乙醇（批號：M8210）、氯仿（批號：20220114）均購自福晨（天津）化學試劑有限公司；無水乙醇（批號：20211018）購自天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.3 儀器 Tone 96G型PCR擴增儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；H3018DR型高速冷凍離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司）；JX-10型干式恒溫器金屬浴（上海凈信實業發展有限公司）；OD-1000分光光度計（One Drop）、GoodSee-5型薄層色譜成像儀（上海科哲生化科技有限公司）；1704482水平電泳儀（BIO-RAD）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多公司）；KJXH-Ⅱ型旋渦混合器（江蘇康捷醫療器械有限公司）。

2 方法

2.1 DNA提取 取小秦艽樣品（全草）約35 mg，加入液氮充分碾磨；采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

2.2 DNA濃度檢測 取1 μL已提取的DNA溶液樣品，用分光光度計測定所提取的DNA的濃度。

2.3 PCR擴增

2.3.1 引物 本研究使用的引物ITS2（5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’）和ITS3（5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司定制合成。引物稀釋至10 μmol/L。

2.3.2 反應體系 反應體系體積為25 μL，其中DNA模板1 μL，正、反引物各1 μL，TIANSeq高保真PCR反應預混液（NG219）12.5 μL，并用ddH2O補足剩余體積。

2.3.3 循環參數 通過前期實驗對反應條件的多次考察，最終確定94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃延伸30 s，68 ℃復性15 s，共35個循環；68 ℃5 min；4 ℃保存30 min。

2.4 電泳 取1.0 g Agarose溶解于100 mL的1×TAE Buffer，于60 ℃加入10 μL的GelStain核酸染色劑（10 000×水溶液），混勻，冷卻；用1%的瓊脂糖凝膠，取PCR產物和Marker各5 μL，點樣，于160 V、400 mA條件下電泳35 min。

2.5 PCR產物測序 將PCR產物測序，產物均由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，每個樣品均采用正、反雙向測序。

2.6 構建系統發育樹 用Bio Edit軟件查看測序峰圖，核對前后截取位點；再用CLC Sequence Viewer 8軟件查看結果序列并轉化格式；最后用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）11.0軟件進行多重序列比對，根據Kimura-2-parameter（K2P）計算遺傳距離，采用鄰位相接法（NJ法）利用樣品ITS2序列構建系統發育樹。

2.7 龍膽苦苷含量測定 前期課題組對相似采樣點的小秦艽樣品進行含量測定分析，方法依照2020年版《中華人民共和國藥典》一部秦艽中龍膽苦苷高效液相色譜法含量測定的要求。

3 結果

3.1 各樣品DNA濃度 采集的各樣品提取的DNA濃度見表2。

表2 DNA 濃度檢測表

續表2：

3.2 PCR產物凝膠電泳 采集的各樣品PCR產物凝膠電泳圖見圖1。

圖1 小秦艽樣品凝膠電泳圖

3.3 序列分析 測得的62條序列中恒定位點（C）、變異位點（V）、簡約信息位點（Pi）和單態位點（S）的個數分別為318、129、75和54，其中變異位點占28.79%（129/448）。根據MEGA11.0軟件分析結果顯示，所有樣品總位點數（Number Sites）為448。

3.4 遺傳距離 通過MEGA 11.0軟件檢測不同產地的小秦艽ITS2基因序列的遺傳距離，種內遺傳距離范圍為0.000 0～0.263 2，平均種內遺傳距離為0.049 4。

3.5 系統發育分析 根據NJ樹結果顯示，62份小秦艽樣品分為兩支，編號為BT1（采自包頭市白云鄂博巴潤園區東南1 km處）和BY1（采自巴彥淖爾盟烏拉特前旗阿嘎如泰蘇木大樺背）的樣品聚為一個小分支，其余60份樣品聚為一個大的分支。通過ITS2序列構建的系統發育樹見圖2。

圖2 ITS2 序列構建系統發育樹

3.6 樣品龍膽苦苷含量比較分析 根據課題組小秦艽前期實驗研究中相似采樣點樣品的主要有效成分龍膽苦苷含量，比較發現聚在小分支上的BTI和BY1有相似的龍膽苦苷含量；同樣的，聚在另一大支上的WL1、CF9、XL6、XL2、BT9、XL1、HH13、BT5、BT4、WL3、HH14、WL9、WL2和CF1的龍膽苦苷含量相似。具體樣品含量見表3。

表3 小秦艽樣品中龍膽苦苷含量

4 討論

本實驗研究了62份內蒙古不同產地的小秦艽樣品的ITS序列，探索其在不同地理環境下的遺傳變異情況。從NJ樹上來看，編號為BT1（采自包頭市白云鄂博巴潤園區東南1 km處）和BY1（采自巴彥淖爾盟烏拉特前旗阿嘎如泰蘇木大樺背）的樣品聚為一支，說明有較近的親緣關系。深入分析這兩份樣品的序列，可以發現BTI和BY1有46個相同的變異位點，占各自變異位點的48.4%（46/95）和85.2%（46/54）；二者有3個特征變異位點，分別為104 bp-G，155 bp-G，251 bp-A。在相似的遺傳變異條件下，以張明旭等[5]內蒙古不同產地小秦艽中主要有效成分龍膽苦苷含量測定結果為參考，發現BTI和BY1有相似的龍膽苦苷含量；同樣的，聚為另一大支的小秦艽樣品中WL1、CF9、XL6、XL2、BT9、XL1、HH13、BT5、BT4、WL3、HH14、WL9、WL2和CF1的龍膽苦苷含量相似。然而，影響貢獻率較大的生態因子在各個樣品中存在顯著差異，進一步排除生態環境對于龍膽苦苷含量的影響，由此推測小秦艽主要有效成分龍膽苦苷的含量可能與遺傳變異過程相關。

樣品BT1和HH4（采自呼和浩特市和林格爾縣太平夭），BT1和AL1（采自阿拉善左旗巴潤別立鎮賀蘭山雪嶺子溝）遺傳距離最大，均為0.236 2，說明其存在明顯的遺傳變異差異。考慮地理距離較大的原因，推測地理環境因素在一定程度上影響了小秦艽的生物進化過程。這樣的推測也被研究證實，如張明旭等[7]采用增強回歸樹模型對內蒙古小秦艽的生態適宜區進行了模擬，研究影響其生長的生態因子，結果表明，海拔和土壤類型對于小秦艽的生長分布有顯著的影響。根據系統發育樹，可看出在同一地域生長的樣品并不一定包含在同一個分支內，不同地域生長的樣品也可能包含在同一個分支中，表明不同的小秦艽樣品之間存在遺傳的變異，但是差異并不顯著。不同產地的小秦艽樣品存在一定程度的基因交流，但并不完全按照地理分布聚類。除了地理因素之外，還有許多因素影響著生物的遺傳與進化，還需進一步的研究和探索[19]。

遺傳多樣性使物種進化潛力和生物多樣性得到了相對有效的保障。一般情況下，遺傳變異越豐富，適應環境的能力就越強，越容易擴展其分布范圍[20]。在漫長的演化過程中，多種因素會影響物種的遺傳多樣性，自然選擇及繁育系統等都是導致種群遺傳變異的重要因素之一[21]。因此，選擇DNA分子技術—ITS序列有助于研究藥用植物小秦艽種質資源遺傳多樣性，了解種內遺傳變異的大小及其與環境的關系，從而保護及發展小秦艽種源優勢。