痹痛散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

蘇 捷，楊賢海，付大清，陽國彬，鄭光明，馬小青

（1.荊門市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 荊門 448000；2.襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

痹痛散為荊楚名老中醫(yī)朱必泉臨床治療痹證的外用驗(yàn)方，現(xiàn)由荊門市中醫(yī)醫(yī)院擬開發(fā)研制。痹痛散由地黃、當(dāng)歸、三七、丹參、乳香、沒藥6味藥材組成。方中地黃為君藥，有逐血痹、填骨髓、長肌肉之功效[1]；當(dāng)歸、三七、丹參共為臣藥，當(dāng)歸、丹參有活血化瘀、通脈止痛之功[2-3]；三七具有散瘀止血、消腫定痛之效[4-5]；乳香、沒藥為佐藥，有活血祛瘀、消腫止痛的功效[6-8]；上述諸藥共奏化瘀止痛、活血除痹之功。痹痛散在我院臨床應(yīng)用多年，治療各種痹證，療效確切。為保障制劑臨床有效性和質(zhì)量穩(wěn)定性，本研究采用TLC對制劑中地黃、當(dāng)歸、三七進(jìn)行定性鑒別，并以毛蕊花糖苷、阿魏酸及丹酚酸B的含量為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用HPLC法對其進(jìn)行含量測定，以期為痹痛散的質(zhì)量控制和制劑研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1525高效液相色譜儀（美國Water公司）；FA2204B型萬分之一電子天平、GE0505型十萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；ZF-6型三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；WSN-C08-S型超純水器（長沙沃恩環(huán)保科技有限公司）；KQ-250B型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 當(dāng)歸對照藥材（批號(hào)：120927-201617）、毛蕊花糖苷對照品（批號(hào)：111530-201914，純度：95.2%）、梓醇對照品（批號(hào)：110808-202112，純度：98.8%）、人參皂苷Rg1對照品（批號(hào)：110703-202034，純度：94.0%）、三七皂苷R1對照品（批號(hào)：110745-201921，純度：90.4%）、人參皂苷Rb1對照品（批號(hào)：110704-202028，純度：93.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸B對照品（批號(hào)：MUST-2103110，純度：98.60%）、阿魏酸對照品（批號(hào)：MUST-21060504，純度：99.94%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；藁本內(nèi)酯對照品（批號(hào)：DST190315-007，純度：98.52%）購自成都德思特生物科技有限公司；色譜級(jí)乙腈（批號(hào)：L9A0T49）購自北京百靈威科技有限公司；硅膠G薄層板（批號(hào)：20190506）購自青島海洋化工廠分廠；色譜級(jí)磷酸（批號(hào)：C1907082）購自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為分析純。痹痛散（批號(hào)：20210901，20210902，20210903，20211001，20211002）、缺地黃陰性樣品、缺當(dāng)歸陰性樣品、缺三七陰性樣品及缺丹參陰性樣品由我院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 地黃、當(dāng)歸、三七的定性鑒別

2.1.1 地黃的鑒別 取痹痛散1 g，加10 mL甲醇超聲提取1 h，濾過并蒸干濾液，殘?jiān)? mL甲醇溶解，制成供試品溶液。另取缺地黃陰性樣品1 g，同法制成陰性對照溶液。再取梓醇對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的梓醇對照品溶液。吸取上述各溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-水-甲醇（7∶0.5∶3）的混合溶液進(jìn)行展開，取出晾干，噴茴香醛試液，在105 ℃條件下加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。（見圖1）

圖1 地黃的TLC 圖

2.1.2 當(dāng)歸的鑒別 取痹痛散3 g，加乙醚20 mL，超聲10 min，濾過蒸干濾液，殘?jiān)? mL乙醇溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材1 g、缺當(dāng)歸陰性樣品3 g，同法分別制成當(dāng)歸對照藥材溶液及陰性對照溶液。再取藁本內(nèi)酯對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的藁本內(nèi)酯對照品溶液。吸取上述各溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正己烷（1.5∶6.0）的混合溶液進(jìn)行展開，取出晾干，置于365 nm紫外光下觀察。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與當(dāng)歸對照藥材及對照品色譜的相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。（見圖2）

圖2 當(dāng)歸的TLC 圖

2.1.3 三七的鑒別 取痹痛散3 g，加1.5 mL水?dāng)噭颍偌? mL水飽和的正丁醇振搖10 min，靜置，取上清液，加3倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層，取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺三七陰性樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。再取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成分別含各成分0.25 mg/mL的混合對照品溶液。取上述各溶液1 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-氯仿-水（8∶4.4∶3∶2）10 ℃以下放置的下層溶液進(jìn)行展開，取出晾干，噴10%硫酸溶液，在105 ℃條件下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置于365 nm紫外光下檢視，顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。（見圖3）

圖3 三七的TLC 圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～10 min，2%A～10%A；10～30 min，10%A～35%A；30～35 min，35%A～40%A；35～40 min，40%A～2%A），檢測波長為316 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品0.00318g、阿魏酸對照品0.00385g、丹酚酸B對照品0.01580g，置于25 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解制成含毛蕊花糖苷、阿魏酸、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.121 1、0.153 9、0.623 2 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL至10 mL容量瓶，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含毛蕊花糖苷、阿魏酸、丹酚酸B分別為12.11、15.39、62.32 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取痹痛散（批號(hào)：20210901）及各陰性樣品2g，分別置于錐形瓶內(nèi)，精密加入80%甲醇50 mL，稱質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻至室溫后再稱質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后濾過，制成供試品溶液及各陰性對照溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及各陰性對照溶液各20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液中各目標(biāo)成分色譜峰與對照品色譜峰在同一保留時(shí)間，供試品溶液中各目標(biāo)成分與其他雜質(zhì)色譜峰均能達(dá)到基線分離，且各陰性對照溶液無干擾，表明含量測定方法專屬性強(qiáng)。（見圖4）

圖4 痹痛散HPLC 色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻后過濾，制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的溶液。精密吸取上述6個(gè)溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，對質(zhì)量濃度（X）-峰面積（Y）作回歸分析，各目標(biāo)成分在各進(jìn)樣濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 各成分的回歸方程及線性范圍

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)混合對照品溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)測定6次，測得毛蕊花糖苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.21%、0.97%、1.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)供試品溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，測得毛蕊花糖苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.11%、1.31%、1.05%，表明制備的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取2 g痹痛散（批號(hào)：20210901）6份，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定。結(jié)果毛蕊花糖苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.26%、1.69%、1.82%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取毛蕊花糖苷對照品0.01218 g、阿魏酸對照品0.002 95 g、丹酚酸B對照品0.016 94 g置于10 mL容量瓶內(nèi)，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度作為母液（毛蕊花糖苷1.1595mg/mL、阿魏酸0.2948mg/mL、丹酚酸B1.6703 mg/mL）。精密吸取母液1 mL至50 mL容量瓶，加80%甲醇稀釋至刻度，制成含毛蕊花糖苷0.023 2 mg/mL、阿魏酸0.005 9 mg/mL、丹酚酸B 0.033 4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密稱取6份含量已知的痹痛散（批號(hào)：20210901）約1 g，精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL及80%甲醇45 mL，按“2.2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，各成分回收率見表2。

表2 痹痛散各成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 供試品含量測定 精密稱取各批次痹痛散2 g，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，根據(jù)峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 痹痛散各成分的含量測定結(jié)果 （±s，mg/g，n=3）

表3 痹痛散各成分的含量測定結(jié)果 （±s，mg/g，n=3）

批號(hào)毛蕊花糖苷阿魏酸丹酚酸B 20210901 0.114 2±0.001 8 0.030 3±0.000 6 0.164 7±0.003 2 20210902 0.101 1±0.001 6 0.041 2±0.000 8 0.142 6±0.002 5 20210903 0.122 1±0.002 4 0.024 9±0.000 4 0.194 2±0.001 8 20211001 0.116 6±0.001 1 0.023 0±0.000 4 0.170 9±0.002 2 20211002 0.103 4±0.002 1 0.028 7±0.000 5 0.155 7±0.002 7

3 討論

3.1 定性鑒別藥材的選擇 痹痛散共由6味藥材組成，為保證制劑質(zhì)量及臨床療效，本研究參考2020年版《中華人民共和國藥典》[6]及文獻(xiàn)采用TLC對痹痛散中君藥地黃和臣藥當(dāng)歸[9]、三七進(jìn)行定性鑒別，并進(jìn)行專屬性、系統(tǒng)適用性及耐用性試驗(yàn)。結(jié)果地黃、當(dāng)歸和三七的TLC色譜斑點(diǎn)清晰，各成分斑點(diǎn)與雜質(zhì)能完全分離，方法專屬性強(qiáng)，且陰性對照無干擾。

3.2 含量測定質(zhì)量標(biāo)志成分的確定 不同中藥材所含成分各不相同，且包含的化學(xué)物質(zhì)種類繁多，所以制成的中藥復(fù)方制劑成分也極為復(fù)雜。僅通過單一指標(biāo)成分的測定，不能完全評(píng)價(jià)復(fù)方制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性及有效性。痹痛散君藥地黃用量最大，地黃中的毛蕊花糖苷為其活血化瘀有效成分[10]。現(xiàn)代研究表明，毛蕊花糖苷具有抗血小板聚集、抗血栓、抗氧化等生物活性[11-13]。當(dāng)歸中有機(jī)酸類成分可作為當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)志物[14]，有機(jī)酸類阿魏酸為當(dāng)歸補(bǔ)血、活血的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。丹酚酸B作為丹參主要活性成分之一，具有抑制血小板聚集，防止血栓形成的藥理作用[16-17]，可作為丹參活血化瘀功效的潛在標(biāo)志物[18]。為確保制劑的療效穩(wěn)定、可靠，本研究將毛蕊花糖苷、阿魏酸及丹酚酸B確定為痹痛散含量測定質(zhì)量標(biāo)志成分。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 本研究考察65%、80%、95%甲醇溶液的提取效果，結(jié)果顯示經(jīng)超聲提取30 min后，80%甲醇溶液提取效果最優(yōu)。確定提取溶劑后，本研究還考察了超聲30 min與加熱回流30 min的提取效果，結(jié)果表明與超聲30 min比較，加熱回流30 min對毛蕊花糖苷及阿魏酸的提取更徹底。

3.4 流動(dòng)相的確定 本研究參考文獻(xiàn)[19-20]考察了0.1%磷酸溶液-甲醇與0.1%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相的洗脫效果。結(jié)果，與0.1%磷酸溶液-甲醇比較，采用0.1%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，3個(gè)指標(biāo)成分的保留時(shí)間均較短，且峰形更佳；故確定0.1%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相。

綜上所述，本研究建立的TLC方法能夠?qū)Ρ酝瓷⒅械牡攸S、當(dāng)歸及三七進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，且方法簡便可靠，專屬性強(qiáng)。建立了可同時(shí)測定痹痛散中毛蕊花糖苷、阿魏酸及丹酚酸B的HPLC方法。由于中藥材的產(chǎn)地、生長氣候、采收時(shí)節(jié)、炮制加工方法不同，導(dǎo)致中藥材成分含量差距較大。本研究僅檢測了5批樣品，樣本批次較少，故在制定痹痛散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)無法準(zhǔn)確制定各成分的含量限度。后期將在此基礎(chǔ)上采用不同來源的中藥材進(jìn)行樣品制備，并增加樣本數(shù)量，以獲取準(zhǔn)確的含量限度數(shù)據(jù)，為痹痛散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可靠依據(jù)。