水提和醇提對(duì)智腦膠囊的指標(biāo)成分含量和指紋圖譜影響研究*

李 翔，汪永忠,2，韓燕全,2，楊文明

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)/中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，安徽 合肥 230031）

近年來(lái)，隨著該方臨床應(yīng)用患者群越來(lái)越廣，簡(jiǎn)單的湯劑用藥已經(jīng)滿足不了患者的實(shí)際需求。因此，本課題組一直希望能將該方開(kāi)發(fā)成膠囊劑，以方便于臨床應(yīng)用，服務(wù)更多的患者。近年研究表明，智腦膠囊處方藥材所含的松果菊苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素等有效成分，均具有較好的醇溶性，鑒于智腦膠囊方一直以水煎煮湯劑形式應(yīng)用于臨床，若將其制備成現(xiàn)代制劑，則水提、醇提的差異及效果需要進(jìn)一步的研究。本研究擬對(duì)該方的水提和醇提效果從指標(biāo)成分和指紋圖譜角度進(jìn)行系統(tǒng)比較，以期能為該方的膠囊劑開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 Waters Acquity H-Class超高效液相色譜儀、Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（美國(guó)Waters公司）；KDC-16H型離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）；BZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；DK-S24型水浴鍋（上海三發(fā)儀器有限公司）；1510型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司）；R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；ME55型十萬(wàn)分之一天平[梅特勒-托利（上海）有限公司]；KQ3200DB型超聲儀（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；0.22 μm微孔濾膜[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]；回流提取設(shè)備自制。

1.2 材料 黨參（批號(hào)：2003051）、黃芪（批號(hào)：2005183）、黃精（批號(hào)：2006033）、肉蓯蓉（批號(hào)：1912122）、郁金（批號(hào)：2004233）、石菖蒲（批號(hào)：2001292）、川芎（批號(hào)：2005281）及地龍（批號(hào)：2004221）均購(gòu)自安徽普仁中藥飲片有限公司，以上中藥飲片經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李立華主任中藥師鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》性狀鑒別項(xiàng)下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。松果菊苷對(duì)照品（批號(hào)：111670-200503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.1%）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：DST61276-17-3，純度≥98%）、毛蕊異黃酮苷對(duì)照品（批號(hào)：DST171107-013，純度≥98%）、黨參炔苷對(duì)照品（批號(hào)：DST200325-035，純度≥98%）均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；蒸餾水（批號(hào)：20220208）購(gòu)自屈臣氏食品飲料有限公司；色譜純甲醇（批號(hào)：22045156）、乙腈（批號(hào)：21100713）均購(gòu)自TEDIA公司；分析純乙醇（批號(hào)：20807110）購(gòu)自上海潤(rùn)捷試劑公司。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 水提工藝樣品的制備 在前期單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，按照智腦膠囊配比，稱取1倍處方量的藥材，加入8倍藥材量的水，浸泡30 min后大火煮沸，保持沸騰狀態(tài)1 h，取出煎煮液；向藥渣中加入8倍量水，煎煮40 min，合并煎煮液。減壓蒸餾回收至生藥溶度為1 g/mL，按此方法制得10批水提工藝樣品。樣品批號(hào)分別為220401、220402、220403、220404、220405、220406、220407、220408、220409和220410，以下簡(jiǎn)稱S1～S10。

2.1.2 醇提工藝樣品的制備 在前期單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，按照智腦膠囊配比，稱取1倍處方量的藥材，加入10倍藥材量的75%乙醇，浸泡30 min，加熱回流提取60 min，取出煎煮液；向藥渣中加入8倍量的75%乙醇，繼續(xù)回流40 min，合并煎煮液。減壓蒸餾回收乙醇，繼續(xù)濃縮至生藥濃度為1 g/mL，按此方法制得10批醇提工藝樣品。樣品批號(hào)分別為220411、220412、220413、220414、220415、220416、220417、220418、220419和220420，以下簡(jiǎn)稱C1～C10。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密吸取各批次水提、醇提工藝樣品1 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，振蕩混勻后靜置2h，再取上清液1.5mL于2 mL EP管內(nèi)，12000 r/min（離心半徑為5.89 cm）離心10 min，取上清液用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，續(xù)濾液置于進(jìn)樣瓶中，備用。

也許是去年效益好的緣由，今年的園里栽了不少美人嬌花，園林的負(fù)責(zé)人說(shuō)，美人蕉花是雞冠花好幾倍，難怪前些年那片土慌著。給人一種園好企業(yè)興的感覺(jué)。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取松果菊苷對(duì)照品6.26 mg、毛蕊花糖苷對(duì)照品8.46 mg、毛蕊異黃酮苷對(duì)照品5.02 mg、黨參炔苷對(duì)照品5.31 mg、槲皮素對(duì)照品5.21 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容得各對(duì)照品母液；再分別吸取各上述各對(duì)照品母液0.5、0.5、0.1、0.1、0.1 mL，置于另一10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，得到松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.313、0.423、0.050、0.053、0.052 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4 智腦膠囊水提、醇提工藝樣品的指標(biāo)成分含量比較研究

2.4.1 色譜條件[8-9]Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A、0.05%甲酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，時(shí)間程序?yàn)椋?～5 min，3%A～20%A，5～9 min，20%A ～30%A；9～12 min，30%A ～35%A；12～13 min，35%A ～50%A；13～18 min，50%A～55%A；18～20 min，55%A～60%A；20～22 min，60%A～100%A；流速：0.20 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：2 μL。在此條件下，得混合對(duì)照品、智腦膠囊水提工藝樣品、智腦膠囊醇提工藝樣品的UPLC圖譜。（見(jiàn)圖1）

圖1 UPLC 圖

2.4.2 線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，另取一份未稀釋的混合對(duì)照品液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積。以松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素5種指標(biāo)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并線性擬合，計(jì)算得出回歸方程見(jiàn)表1。通過(guò)計(jì)算回歸方程r值可得出，這5種指標(biāo)成分的進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 5 種成分回歸方程

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取智腦膠囊醇提C1樣品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素的峰面積的RSD分別為2.04%、2.76%、2.58%、1.22%、2.91%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取智腦膠囊醇提C1樣品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素的峰面積的RSD分別為2.33%、2.68%、2.76%、1.21%、2.90%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取智腦膠囊醇提C1樣品溶液一定量，分為6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定5種成分的峰面積，計(jì)算5種成分含量和RSD值，結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素平均含量分別為3.701、3.816、0.401、0.152、0.095 mg/g，RSD分別為2.07%、2.19%、2.42%、2.51%和2.85%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取智腦膠囊醇提C1樣品提取液6份，每份吸取0.5 mL，分別精密加入與供試品中指標(biāo)成分含量接近的對(duì)照品溶液，加甲醇定容至10 mL，振蕩混勻，靜置，12 000 r/min離心10 min，使用0.22 μm的針頭濾膜過(guò)濾裝入進(jìn)樣瓶，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為1 μL，計(jì)算各成分的加樣回收率。加樣回收率（%）=（測(cè)得量-樣品中含量）/加入量×100%。結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為97.11%、97.37%、99.35%、99.41%、98.72%；RSD分別為2.96%、2.26%、2.03%、2.47%、2.17%，表明方法準(zhǔn)確度良好。（見(jiàn)表2）

表2 5 種成分加樣回收率試驗(yàn) （n=6）

2.4.7 智腦膠囊水提、醇提工藝樣品的指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果 取10批智腦方膠囊水提工藝樣品溶液（S1～S10）和10批智腦方膠囊醇提工藝樣品溶液（C1～C10）各1 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算5種指標(biāo)物質(zhì)的含量，并計(jì)算各成分的變化率。變化率=（醇提工藝平均含量-水提工藝平均含量）/水提工藝平均含量×100%。結(jié)果顯示，與水提工藝樣品比較，醇提工藝樣品中松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮苷、黨參炔苷、槲皮素含量分別增加了42.25%、28.82%、3.52%、31.99%、130.73%。表明從指標(biāo)成分含量角度來(lái)看，醇提工藝提取率優(yōu)于水提工藝。（見(jiàn)表3～4）

表3 智腦膠囊水提工藝指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

表4 智腦膠囊醇提工藝指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

2.5 智腦膠囊水提、醇提工藝樣品的指紋圖譜比較研究[10-11]

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取智腦膠囊醇提C1樣品溶液1 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。樣品中主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積差異較小，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2004（A版）”（簡(jiǎn)稱相似度評(píng)價(jià)軟件，下同）計(jì)算其相似度大于0.996，表明實(shí)驗(yàn)精密度較好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取智腦膠囊醇提C1樣品溶液1 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，采集色譜圖，并采用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算其相似度，結(jié)果指紋圖譜相似度均大于0.992，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)下醇提工藝方法制備樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份智腦膠囊醇提工藝供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣采集圖譜，并采用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算其相似度，結(jié)果6份樣品的相似度均大于0.990，樣品處理過(guò)程的重復(fù)性較好。

2.5.4 指紋圖譜測(cè)定與建立 按照“2.1.1”項(xiàng)下水提工藝方法和“2.1.2”項(xiàng)下醇提工藝方法制備樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備智腦膠囊水提、醇提供試品溶液各10批，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并采集指紋圖譜，利用相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行疊加比較，得到10批智腦膠囊水提工藝樣品和10批智腦膠囊醇提工藝樣品的疊加指紋圖譜，通過(guò)匹配共得到智腦膠囊水提工藝樣品共有色譜峰14個(gè)，智腦膠囊醇提工藝樣品共有色譜峰19個(gè)，其中15～19號(hào)色譜峰主要為醇提工藝樣品所有。（見(jiàn)圖2）

圖2 疊加指紋圖譜

2.6 智腦膠囊水提、醇提工藝樣品指紋圖譜結(jié)果分析[12-13]

2.6.1 指紋圖譜的直觀比較與色譜峰歸屬 將智腦膠囊水提、醇提工藝樣品指紋圖譜導(dǎo)出，通過(guò)與混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對(duì)比，確定部分峰歸屬并進(jìn)行直觀分析。通過(guò)與混合對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)了其中5個(gè)特征峰，分別為松果菊苷（6）、毛蕊花糖苷（7）、毛蕊異黃酮苷（8）、黨參炔苷（10）、槲皮素（14），由圖3智腦膠囊水提、醇提工藝樣品和混合對(duì)照品圖譜可知，智腦膠囊水提工藝樣品（S）和智腦膠囊醇提工藝樣品（C）在a和b 2個(gè)區(qū)域的色譜峰存在明顯差異。尤其是b區(qū)域，智腦膠囊醇提工藝樣品有5個(gè)相應(yīng)值較高的色譜峰，智腦膠囊水提工藝樣品則在此區(qū)域則無(wú)色譜峰，表明智腦膠囊醇提工藝樣品的可檢測(cè)成分?jǐn)?shù)明顯多于水提工藝樣品。（見(jiàn)圖3）

圖3 指紋圖譜

2.6.2 指紋圖相似度評(píng)價(jià) 將所得的10批智腦膠囊水提工藝樣品和10批智腦膠囊醇提工藝樣品UPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2004（A版）”，計(jì)算得到智腦膠囊水提和醇提工藝樣品的相似度。其中智腦膠囊水提工藝樣品的相似度均大于0.931，智腦膠囊醇提工藝樣品的相似度均大于0.937，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明同一提取方式得到的樣品相似度值較好。（見(jiàn)表5～6）

表5 智腦膠囊水提工藝樣品相似度

表6 智腦膠囊醇提工藝樣品相似度

2.6.3 聚類分析和OPLS-DA分析 采用SIMCA 13.0軟件對(duì)10批智腦膠囊水提工藝樣品和10批智腦膠囊醇提工藝樣品進(jìn)行聚類分析和OPLS-DA分析。從聚類分析圖可見(jiàn)，智腦膠囊水提工藝樣品和智腦膠囊醇提工藝樣品可以分別聚成兩類。（見(jiàn)圖4）OPLS-DA二維投影圖可見(jiàn)，C1～C10被聚在1個(gè)象限內(nèi)距離相近，S1～S10聚在1個(gè)象限內(nèi)距離相近。聚類分析和OPLS-DA結(jié)果相互印證，表明智腦膠囊水提工藝樣品和醇提工藝樣品內(nèi)在質(zhì)量差異明顯。

圖4 智腦膠囊水提、醇提工藝樣品聚類分析樹(shù)狀圖

圖5 智腦膠囊水提、醇提工藝樣品OPLS-DA 分析圖

3 討論

阿爾茨海默病（AD）是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，也是一種老年性疾病[14]。我國(guó)人口基數(shù)龐大，隨著人口老齡進(jìn)程加快，AD患者數(shù)量將不斷增加，預(yù)計(jì)2050年我國(guó)AD患者數(shù)量將超過(guò)兩千萬(wàn)人[15]。因而，尋找有效的治療藥物是防治該疾病的重要手段之一。智腦膠囊前期一直以湯劑應(yīng)用于臨床，用于治療阿爾茨海默病，療效確切。課題組前期曾嘗試用其水提物加工成膠囊劑，其浸膏得率達(dá)到30%以上，制成膠囊后患者日服用量過(guò)大，所以課題組一直探索其乙醇提取的合理性[16-17]，為其開(kāi)發(fā)成膠囊劑奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)比較智腦膠囊水提和醇提工藝樣品的指標(biāo)成分含量的差異性和指紋圖譜，以期能為其最終采用醇提工藝提供依據(jù)。本研究結(jié)果表明，指標(biāo)成分含量和UPLC指紋圖譜研究方面，醇提工藝樣品指標(biāo)成分含量和指紋圖譜色譜峰數(shù)目明顯優(yōu)于水提工藝，這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相合[18-19]，結(jié)果提示乙醇提取更有利于提高智腦膠囊有效成分的提取率。

課題組前期對(duì)智腦膠囊水提工藝和醇提工藝的主要參數(shù)如提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溶劑倍數(shù)、乙醇濃度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化[16-17]，最終采用的提取條件為優(yōu)化后提取條件。指標(biāo)成分含量測(cè)定和指紋圖譜建立過(guò)程中，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%甲酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)；考察了BEH-C18（100mm×2.1mm，1.7 μm）、Shim-packsceper C18-120（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）和Ace Excel C18（100 mm×2.1 mm，2.0 μm）等不同品牌和型號(hào)的色譜柱；同時(shí)，對(duì)柱溫、流動(dòng)相洗脫速度和程序、測(cè)定波長(zhǎng)等色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終優(yōu)化得到本研究的樣品測(cè)定條件。

本研究的不足之處是測(cè)定的5種成分只分屬于智腦膠囊的肉蓯蓉、黃芪和黨參3味藥材，另5味藥材的有效成分未能在此測(cè)定條件下進(jìn)行檢測(cè)；此外，UPLC指紋圖譜也只指認(rèn)了上述的5種成分，后期考慮采用LC-MS等方法確認(rèn)其更多的成分。指標(biāo)成分含量和指紋圖譜方面比較結(jié)果表明，智腦膠囊用75%乙醇提取較水提效果更佳，但是否最終以乙醇提取代替?zhèn)鹘y(tǒng)的水提工藝，還需要進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證[20]。