全真一氣湯通過HIF-1α/VEGF通路抑制COPD大鼠氣道重塑的研究*

張旺生，王世聰，陳 慧，陳永忠，林秀明，陳 成，楊裕華，李 希

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）已經(jīng)成為全球三大死亡原因之一，全球30歲以上的人群COPD的患病率約為11.7%[1]。而且中國20歲及以上成人慢阻肺患病率為8.6%，40歲以上人群患病率高達13.7%，估算我國患者近1億[2]。慢性缺氧是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要病理因素，可造成氣道、肺實質(zhì)及肺血管等組織結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑。若未能進行及時早期篩查、診斷和治療，后期常出現(xiàn)慢性肺源性心臟病，嚴重者出現(xiàn)呼吸衰竭及右心功能衰竭等并發(fā)癥危及生命。

研究[3]發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）不僅在COPD炎癥過程中起著重要作用，還可通過調(diào)控相應(yīng)靶基因參與氣道重塑。本課題組在前期的研究發(fā)現(xiàn)，全真一氣湯對腎不納氣證COPD大鼠具有抑制氣道重塑作用，但其相關(guān)機制尚未明確。本研究運用全真一氣湯干預(yù)COPD大鼠，通過觀察氣道和肺組織病理變化情況及檢測肺組織HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、閉合蛋白（occloudin）、閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）蛋白的表達水平，探討全真一氣湯抑制COPD大鼠氣道重塑的機制，進一步明確其治療COPD的作用靶點和機制，從而為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠39只，體質(zhì)量180～200 g，購自福州諾敦斯生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。大鼠飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心，于溫度（22±2）℃、濕度（55±5）%恒定條件下標準飼料喂養(yǎng)，人工光源明暗照射12 h，24 h自由飲水和食物。動物實驗全程遵守福建中醫(yī)藥大學(xué)關(guān)于動物實驗倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定，批準文號：FJATCM-IAEC20210421。

1.2 藥物與試劑 全真一氣湯，方藥組成：熟地黃15 g，白術(shù)6 g，人參15 g，麥冬15 g，五味子6 g，附子6 g，牛膝15 g。中藥飲片購自福建省藥材公司，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院倪立堅副主任藥師鑒定為正品，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制備成生藥質(zhì)量濃度為1.0 g/mL、體積為226 mL的湯藥。氨茶堿（批號：2101071，規(guī)格：0.25 g/2 mL）購自寧波美諾華天康藥業(yè)；電鏡固定液（批號：GR2211123）購自中國Servicebio公司；812包埋劑（批號：90529-77-4）購自美國SPI公司；4%多聚甲醛（批號：1406M20512）、HIF-1α（批號：8619071002）、VEGF（批號：S50322080902）、HRP-山羊抗兔（批號：GR2212109）、β-actin（批號：20210913）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號：GR2202155）、顯影定影試劑（批號：GR2204014）均購自中國Servicebio公司；脂多糖（LPS）（批號：GR2207044）購自美國Sigma公司；石獅牌香煙（批號：6901028137416，每支香煙焦油含量：12 mg、Nicotine含量：1.1 mg、CO含量：13 mg）購自福建中煙公司。

1.3 主要儀器 Eclipse Ci-L型正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon公司）；Leica UC7型超薄切片機（德國Leica公司）；Ultra 45°型鉆石切片刀（Daitome）；HT7700型透射電子顯微鏡（日本hitachi公司）；煙熏箱由福建中醫(yī)藥科學(xué)院動物房自制。

1.4 造模與分組 39只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為空白組（n=9）、模型組（n=10）、氨茶堿組（n=10）和全真一氣湯組（n=10）。采用煙熏聯(lián)合脂多糖（LPS）氣管滴注的方法進行COPD模型的制備，除空白組外，模型組、氨茶堿組和全真一氣湯組大鼠在造模的第1、14天采用10%水合氯醛麻醉大鼠，進行無創(chuàng)氣管插管（專利號：ZL202020203846.6）滴注1 μg/μL的LPS 200 μL，滴注后休息1周，開始煙熏大鼠，煙熏頻率為1次/d，一次15支香煙，持續(xù)煙熏28 d。各組取3只進行模型評估，其中模型組、氨茶堿組及全真一氣湯組大鼠若表現(xiàn)為咳嗽、喘息、體質(zhì)量減輕、面容疲憊、皮毛光澤度差等，肺組織病理可見氣道分泌物增多、氣道慢性炎癥及肺泡腔擴張明顯并且破裂、肺泡間隔明顯減少、單位肺泡數(shù)量減少等情況，表明COPD大鼠模型復(fù)制成功。

1.5 實驗給藥 參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》[4]將成人臨床用藥等效劑量換算為大鼠給藥劑量，全真一氣湯含生藥量226 g，參照70 kg成人和200 g大鼠體表面積比值為0.018換算，全真一氣湯組灌胃給予成人等效劑量的全真一氣湯藥液，給藥劑量為40.860 0 g/（kg·d）（相當(dāng)于臨床成人用量的3.230 0 g/（kg·d），氨茶堿組按成人臨床等效劑量的給予相應(yīng)的混懸液灌胃，給藥劑量為0.040 5 g/（kg·d）。空白組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 肺部組織標本采集 取材前大鼠禁食不禁水12 h，采用水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉，待大鼠麻醉后用組織剪刀剪開胸腹部至胸骨，剪開胸骨暴露出肺組織，剪下左肺上葉放入4%多聚甲醛中，以備HE染色和免疫組化檢測使用。再剪下左肺下葉黃豆大小組織放入電鏡固定液4 ℃固定3 h，于透射電子顯微鏡下觀察。其余肺葉于-80 ℃冰箱中凍存，備用。

1.6.2 組織病理學(xué)檢測

1.6.2.1 HE染色 從4%多聚甲醛中取出肺葉組織，修剪組織、不同濃度酒精進行梯度脫水、包埋、切片、脫蠟、染色、封片，鏡下觀察肺組織并拍照。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，分別計數(shù)每張圖片中肺泡的數(shù)量和視野面積。單位長度內(nèi)的肺泡數(shù)量=肺泡的數(shù)量/視野面積。

1.6.2.2 電鏡透射 從電鏡固定液取出肺葉組織，修剪組織、漂洗、固定，不同濃度酒精及丙酮進行梯度脫水、滲透、包埋、切片、染色，最后在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.6.3 免疫組化檢測HIF-1α、occludin、VEGF、ZO-1蛋白表達情況 肺組織經(jīng)對多聚甲醛固定后同HE染色步驟進行脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟后的切片加入枸櫞酸修復(fù)液進行抗原修復(fù)，加入血清封閉，按照試劑盒中操作步驟，加入HIF-1α、occludin、VEGF、ZO-1一抗（稀釋比例1∶1 800）、二抗，室溫下顯色劑染色5 min，切片后鏡下觀察，通過Image pro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)計算平均光密度值。平均光密度值=累積光密度IOD值/陽性像素面積[5]。

1.6.4 Western blotting檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達情況 取出凍存的肺臟組織，加入組織裂解液，進行組織勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min（離心半徑為8.5 cm）離心20 min，吸取上層上清液，進行BCA蛋白濃度測定。測定完成后，5×Loading Buffer和PBS對蛋白樣品進行稀釋，沸水浴5 min。制備分離膠和濃縮膠，進行蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)模分離目標蛋白，脫脂奶粉封閉搖床1 h，并依次加入HIF-1α和VEGF一抗（稀釋比例1∶500），于4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1 h，成像儀進行顯影，采用Image pro-plus 6.0測定目的蛋白HIF-1α、VEGF相對表達量及內(nèi)參條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示。采用Levene檢驗進行方差齊性檢驗。當(dāng)數(shù)據(jù)符合方差齊性和正態(tài)分布時，采用單因素方差分析進行多重比較，采用最小顯著性差異檢驗評價兩組間的差異。方差不齊采用非參數(shù)檢驗。繪圖軟件主要采用GraphPad PriSm8.0。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 實驗結(jié)束時，空白組大鼠動作靈敏，體質(zhì)量增長較快，對外界反應(yīng)靈敏，無死亡情況。模型組大鼠咳、喘息、體質(zhì)量減輕、面容疲憊、皮毛光澤度差，死亡1只。全真一氣湯組大鼠體質(zhì)量較空白組稍有減輕，均略重于模型組，對外界反應(yīng)的靈敏度稍有降低，皮毛光澤度略低，死亡1只。氨茶堿組大鼠體質(zhì)量稍有減輕，對外界反應(yīng)的靈敏度稍有降低，皮毛光澤度稍差，無死亡情況。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變情況 空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無明顯增厚；模型組大鼠可見肺泡腔擴張明顯并且破裂、肺泡間隔明顯增厚，單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量明顯減少；氨茶堿組可見肺泡腔輕度擴張并且部分破裂、肺泡間隔輕度增厚，單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量稍有減少；全真一氣湯組大鼠可見肺泡腔輕度擴張、肺泡間隔輕度增厚，單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量稍有減少。與空白組比較，模型組大鼠可見肺泡腔擴張明顯并且破裂，肺泡間隔明顯增厚，單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，氨茶堿組和全真一氣湯組大鼠可見肺泡擴張有所減少，單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量明顯增加（P＜0.01），提示全真一氣湯可改善COPD引起的肺泡腔擴張、破裂和肺泡間隔增厚，并且可增加單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量。其中，以全真一氣湯組最為明顯，氨茶堿組次之。（見圖1、表1）

表1 各組大鼠單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量比較 （±s）

表1 各組大鼠單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別n 給藥劑量/（g/kg） 單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量/（個/mm2）空白組6-134.71±31.49模型組6-94.69±24.80a氨茶堿組60.040 5112.84±26.65b全真一氣湯組 640.860 0115.11±26.39b F 5.339 P 0.014

2.3 各組大鼠透射電鏡結(jié)果 透射電鏡結(jié)果顯示，空白組大鼠線粒體未見明顯腫脹，大多結(jié)構(gòu)尚可，基質(zhì)較為均勻，嵴存在；模型組大鼠線粒體損傷嚴重，整體呈中、重度腫脹，膜破損，基質(zhì)較多溶解，嵴消失；全真一氣湯組大鼠線粒體未見明顯腫脹，大多結(jié)構(gòu)尚可，基質(zhì)較為均勻，嵴存在；氨茶堿組線粒體損傷嚴重，整體呈中、重度腫脹，膜破損，基質(zhì)較多溶解，嵴消失。4組肺泡Ⅱ型上皮細胞存在一定程度差異性，模型組、氨茶堿組大鼠線粒體損傷最為嚴重，整體呈中、重度腫脹，膜破損，基質(zhì)較多溶解，嵴消失；空白組、全真一氣湯組大鼠線粒體未見明顯腫脹，大多結(jié)構(gòu)尚可，基質(zhì)較為均勻，嵴存在。4組大鼠細胞表面的微絨毛未見明顯差異，數(shù)量較少，排列稀疏。（見圖2）

圖2 各組大鼠肺組織電鏡結(jié)果 （×5 000）

2.4 各組大鼠肺組織HIF-1α、occludin、VEGF、ZO-1平均光密度值比較 與空白組比較，模型組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF平均光密度值明顯升高（P＜0.01），occludin、ZO-1平均光密度值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，氨茶堿組大鼠肺組織HIF-1α平均光密度值均明顯降低（P＜0.05），occludin、ZO-1平均光密度值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，全真一氣湯組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF平均光密度值明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），occludin、ZO-1平均光密度值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖3、表2）

圖3 各組大鼠肺組織HIF-1α、occludin、VEGF、ZO-1免疫組化圖 （×200）

圖4 各組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF 蛋白表達Western blotting 圖

表2 各組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF、occludin、ZO-1 平均光密度值比較 （±s）

表2 各組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF、occludin、ZO-1 平均光密度值比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01。

組別n給藥劑量/（g/kg） HIF-1αVEGFOccludinZO-1空白組6-0.214±0.012 0.171±0.009 0.158±0.014 0.183±0.027模型組6-0.233±0.008b 0.196±0.009b 0.141±0.008a 0.146±0.014a氨茶堿組60.040 50.217±0.007c 0.186±0.010 0.163±0.011c 0.170±0.027c全真一氣湯組 640.860 00.209±0.015d 0.183±0.009c 0.166±0.013d 0.186±0.024c F 9.84312.7069.7178.269 P 0.0200.0050.0210.041

2.5 各組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量比較 與空白組比較，模型組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，氨茶堿組大鼠肺組織VEGF蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.01），HIF-1α蛋白相對表達量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；全真一氣湯組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.01）。（見圖5、表3）

表3 各組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF 蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF 蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別n給藥劑量/（g/kg） HIF-1αVEGF空白組6-0.08±0.010.32±0.03模型組6-1.43±0.14a0.75±0.04a氨茶堿組60.040 51.29±0.050.51±0.05b全真一氣湯組 640.860 00.29±0.02b 0.45±0.05b F 264.99052.226 P 0.0000.000

3 討論

中醫(yī)古籍中未見COPD相關(guān)的病名，但依據(jù)其臨床證候表現(xiàn)及病因病機，可將其歸于“肺脹”“喘證”范疇。依據(jù)COPD發(fā)病規(guī)律，本病總屬于本虛標實之證。腎臟與肺臟通過經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)、精微物質(zhì)生成敷布兩種體系產(chǎn)生密切聯(lián)系[6]。故本病發(fā)展到后期，久病肺虛及腎，金不生水，導(dǎo)致腎氣衰憊，肺不主氣，腎不納氣，常出現(xiàn)呼多吸少、動則氣喘等表現(xiàn)。因此，補肺納腎、陰陽雙調(diào)是中醫(yī)治療肺脹病本虛證的基本治法。

全真一氣湯中熟地黃歸腎經(jīng)，具有補腎益氣、益精填髓功效；制附子辛、甘、大熱，可達回陽救逆、助陽補火作用；生曬參味甘、微苦、性溫，大補元氣，補脾益肺；五味子酸、甘而溫，斂肺滋腎；白術(shù)甘、苦而溫，健脾補氣；牛膝苦、酸而平，補養(yǎng)肝腎；麥冬甘、微苦、微寒，可養(yǎng)胃潤肺，清心除煩。全真一氣湯陰陽俱全，補中有瀉。諸藥共用可達疏經(jīng)通脈、養(yǎng)陰益氣、調(diào)補肺腎之效，具有“方從法出，法隨證立”之意，是治療腎不納氣證的經(jīng)典方劑。

慢性阻塞性肺疾病特征性的病理學(xué)改變是氣道炎癥與重塑，包括氣道、肺實質(zhì)及肺血管的慢性炎癥及組織結(jié)構(gòu)重塑，其共同構(gòu)成COPD氣流受限的病理學(xué)基礎(chǔ)[7-8]。慢性缺氧是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要病理因素，可造成氣道、肺實質(zhì)及肺血管等組織結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑。既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α通過調(diào)控相應(yīng)靶基因參與COPD氣道重塑[3]。低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是由缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活劑，也是氧穩(wěn)態(tài)和生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑[9-10]。HIF-1通過其對血管重塑和血管生成的影響以及通過參與氧化還原穩(wěn)態(tài)和葡萄糖代謝的氧氣利用來介導(dǎo)氧氣輸送[11]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達由HIF-1α誘導(dǎo)，是血管生成和血管通透性的有效調(diào)節(jié)劑。VEGF已被證明參與COPD的發(fā)病機制，HIF-1α調(diào)節(jié)的VEGF過表達可能是慢性支氣管炎的特征[12]。VEGF及其受體VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR/Flk-1）可能在COPD的組織重塑和血管生成中發(fā)揮作用[13]。HIF-1α的表達與VEGF和VEGFR2的表達呈正相關(guān)，HIF-1α、VEGF和VEGFR2表達的增加反映了COPD的疾病嚴重程度，而且HIF-1α、VEGF和VEGFR2的高表達可能與肺功能下降和生活質(zhì)量下降有關(guān)，從而導(dǎo)致COPD的疾病進展[14]。另外，研究發(fā)現(xiàn)[15]缺氧可激活肺組織中HIF-1α/VEGF通道，影響維持肺通透性的緊密連接蛋白occludin與ZO-1表達，進而損傷肺泡上皮細胞及肺泡毛細血管。支氣管上皮作為對抗多種吸入外源性物質(zhì)的前線防御。上皮屏障功能由相鄰細胞之間形成的頂端連接復(fù)合物維持，并由黏附連接下面的頂端緊密連接（TJ）組成[16]。TJ蛋白，如claudin家族、occludin、連接黏附分子（JAM）和閉塞帶（ZO）蛋白及AJ蛋白（如E-鈣黏蛋白）已被證明可構(gòu)成支氣管上皮的交界復(fù)合物，且與健康人相比，COPD患者支氣管上皮和肺組織切片中ZO-1、occludin和E-鈣黏蛋白的表達較弱[17-20]。但COPD氣道重塑是否通過HIF-1α/VEGF通路影響緊密連接蛋白occludin與ZO-1表達有關(guān)，需要進一步研究。

本研究的目的是運用形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)的方法研究全真一氣湯治療COPD大鼠的作用，結(jié)果表明，模型建立成功，全真一氣湯在一定程度上改善COPD大鼠氣道重塑。HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，全真一氣湯組大鼠可見肺泡擴張有所減少，單位面積內(nèi)的肺泡數(shù)量明顯增加；透射電鏡結(jié)果顯示，模型組、氨茶堿組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體損傷最為嚴重，整體呈中重度腫脹，膜破損，基質(zhì)較多溶解，嵴消失，而全真一氣湯組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體未見明顯腫脹，大多結(jié)構(gòu)尚可，基質(zhì)較為均勻，嵴存在。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，全真一氣湯組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量均明顯降低，occloudin、ZO-1蛋白相對表達量均明顯升高，提示HIF-1α、VEGF、occloudin、ZO-1蛋白可能參與COPD氣道重塑。

綜上，全真一氣湯可通過下調(diào)HIF-1α、VEGF蛋白，上調(diào)occloudin和ZO-1蛋白的表達，進而改善COPD大鼠肺臟損傷，達到氣道重塑具有保護作用，可為全真一氣湯治療COPD氣道重塑的作用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。