基于NF-κB信號通路探究木犀草素對宮頸癌細胞增殖和凋亡的調控作用

趙新然，王玉娜，曾 倩

（河北省滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000）

宮頸癌是全球女性第三大惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。宮頸癌主要由持續性人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起，是一種高度可預防的疾病。雖然有效篩查和接種疫苗可以預防最具致癌性的HPV毒株，使宮頸癌的發病率和病死率有所下降[1-2]，但中晚期患者容易發生轉移和復發，預后不良。目前，臨床上治療宮頸癌仍以手術為主，并結合放療、化療，但術后創傷和不良反應較重，影響患者的生活質量。中醫藥對宮頸癌的發生發展具有抑制作用[3]。中藥含有的諸多化學成分已被提取并廣泛應用于臨床實踐，顯示出了較好的療效。木犀草素在自然界分布廣泛，主要來源是全葉青蘭、白毛夏枯草、野菊花、金銀花和紫蘇等植物，是一種天然黃酮類活性物質，可以作為一種抗氧化劑及抗癌劑治療多種疾病，如原發性高血壓、炎癥性疾病和癌癥[4]。木犀草素在治療腫瘤方面具有良好的前景，可以預防和治療肺癌[5]、肝癌[6]、乳腺癌[7]和前列腺癌[8]等多種癌癥。作為細胞因子重要信號傳導途徑，核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路[9]對多種腫瘤細胞[10-11]的增殖和凋亡有著重要的影響，該信號通路的持續激活與腫瘤的發生密切相關。已有研究表明木犀草素能夠通過調節NF-κB信號影響人舌鱗癌細胞的增殖與凋亡[12]。然而，目前木犀草素對NF-κB信號轉導通路與宮頸癌的作用尚不清楚。本研究對木犀草素作用宮頸癌細胞的機制進行進一步的探討，以期為木犀草素開發成治療腫瘤的新藥提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞株 人子宮頸腺癌細胞HeLa細胞系（編號：BNCC 342189，批號：21122303），購自河南省工業微生物菌種工程技術研究中心。

1.2 藥物與試劑 木犀草素（批號：S08GS160295）、BAY 11-7082（NF-κB信號通路抑制劑，批號：J07HS173399）均購自上海源葉生物科技有限公司；引物序列由北京華大基因設計合成；胎牛血清（FBS）（批號：2176404）、DMEM培養基（批號：B20220221）均購自美國Gibco公司；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細胞增殖檢測試劑盒（批號：042621211123）購自上海碧云天生物技術有限公司；Hoechst 33258染色試劑盒（批號：20220304）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；結晶紫（批號：20220318）購自上海碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒（批號：H2107011）、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（批號：H4001330）均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；RIPA裂解液（批號：051322220531）購自上海碧云天生物技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）（批號：221N053）購自美國Gibco公司；鼠抗人NF-κB抗體（批號：10021394）、p-NF-κB抗體（批號：10021523）、細胞周期素D1抗體（Cyclin D1）（批號：10016419）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（批號：10021291）和β-actin（批號：10021787）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（二抗）（批號：20000374）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 BC-J160型細胞培養箱（上海博迅實業有限公司）；MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術有限公司）；7500型實時熒光定量PCR儀器（美國ABI公司）；OI-1000型凝膠成像系統（廣州光儀生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱內，將HeLa細胞系培養于DMEM培養基（含10%FBS）中，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 細胞處理及分組 將HeLa細胞分為對照組、5 μmol/L木犀草素組、10 μmol/L木犀草素組、20 μmol/L木犀草素組，對照組HeLa細胞不做處理，5、10、20 μmol/L木犀草素組HeLa細胞分別以5、10和20 μmol/L木犀草素處理24 h，經過細胞功能（增殖、克隆、凋亡）及Cyclin D1、Caspase-3（增殖和凋亡標志物）蛋白表達水平實驗篩選出10 μmol/L木犀草素進行后續通路驗證實驗，然后將細胞分為對照組、10 μmol/L木犀草素組和抑制劑組，其中抑制劑組用10 μmol/L木犀草素＋2.5 μmol/L BAY 11-7082處理24 h。每個實驗重復3次，設3個復孔。

2.3 觀察指標

2.3.1 EdU法測定HeLa細胞的增殖 將HeLa細胞接種到24孔板中，每孔加約1×105個細胞，取各組干預24 h的細胞，進行EdU處理，去除培養液，用0.5 mL 4%多聚甲醛固定，室溫15 min，用0.5 mL 3%BSA洗滌3次；用0.5 mL 0.3%TritonX-100去除BSA，室溫10 min，再用BSA洗滌3次；12孔板中每孔加200 μL Click反應液（現配現用），室溫避光孵育30 min，3% BSA洗滌3次去除Click反應液；每孔加入0.5 mL Hoechst，室溫避光孵育10 min；再用3% BSA洗滌3次去除Hoechst；裝片，倒置熒光顯微鏡拍照，再用ImageJ軟件處理圖片。EdU陽性染色細胞（紅色）占總細胞（藍色）的百分比表示細胞增殖率。

2.3.2 平板克隆形成法測定HeLa細胞的克隆形成率 將1.2×103個/孔HeLa細胞接種于6孔板，觀察細胞克隆形成情況。培養2周后用甲醇固定15min，再用0.1%結晶紫染液染色30 min，PBS清洗多余的染料，風干后拍照，統計細胞克隆數，計算克隆形成率。細胞克隆形成率（%）=細胞克隆數/接種細胞數×100%。

2.3.3 Hoechst 33258染色法測定HeLa細胞的凋亡情況 將HeLa細胞接種到24孔板中，每孔加約1×105個細胞，干預24 h后，細胞用4%多聚甲醛（現用現配）于4 ℃固定細胞10 min，然后用5 mg/L的Hoechst 33258染色液染色10 min，封固后用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，并隨機選擇3個視野拍照。

2.3.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測HeLa細胞中Cyclin D1mRNA和Caspase-3 mRNA表達水平 取各組干預24 h的細胞，Trizol試劑盒提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄反應，獲取cDNA模版。然后參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進行擴增反應。條件為：預變性5min（95℃）；變性35 s（95 ℃），退火35 s（60 ℃），延伸35 s（72 ℃），設置40次循環。GAPDH作內參，2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列

2.3.5 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測HeLa細胞Caspase-3、Cyclin D1、NF-κB和p-NF-κB蛋白相對表達量 藥物干預24h后，各組細胞在冰上裂解于RIPA液，4 ℃，1 2000 r/min（離心半徑為8 cm）離心20 min，取上清蛋白，變性，制膠，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉PVDF膜（200 mA恒流），封閉2 h（5%脫脂牛奶）后，加入一抗（NF-κB、p-NF-κB、Cyclin D1、Caspase-3和β-actin）4 ℃孵育過夜，然后加入標記的二抗孵育2 h，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統拍照記錄。蛋白灰度值用G表示，蛋白相對表達量=G目的蛋白/G內參蛋白（β-actin）。

2.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布且方差齊，采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 8軟件進行繪圖。

3 結果

3.1 不同濃度木犀草素抑制HeLa細胞增殖及誘導細胞凋亡 不同濃度木犀草素處理HeLa細胞24 h后，EdU陽性細胞數逐漸減少，作用HeLa細胞2周后，細胞克隆形成數逐漸減少。鏡下圖顯示細胞形成的克隆集落，反映了細胞的增殖能力和細胞依賴性；ImageJ軟件定量結果顯示，5 μmol/L木犀草素組細胞增殖率和克隆形成率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），10、20 μmol/L木犀草素組細胞增殖率和克隆形成率低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，不同濃度木犀草素增加了HeLa細胞的凋亡細胞數（細胞核呈亮藍色），且濃度越高凋亡細胞數越多。（見圖1～4）

圖1 各組HeLa 細胞EdU 染色圖 （×20）

圖2 各組HeLa 細胞平板克隆圖 （×20）

圖3 各組HeLa 細胞凋亡圖 （×20）

圖4 各組HeLa 細胞增殖率和克隆形成率比較（±s，n=3）

3.2 不同濃度木犀草素對HeLa細胞Cyclin D1和Caspase-3表達的影響 5 μmol/L木犀草素組HeLa細胞Cyclin D1 mRNA、Caspase-3 mRNA、Cyclin D1蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；10、20 μmol/L木犀草素組HeLa細胞Cyclin D1 mRNA和Cyclin D1蛋白相對表達量均低于對照組，Caspase-3 mRNA和Caspase-3蛋白相對表達量均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（見圖5～6）。故本實驗選擇較低濃度（10 μmol/L）木犀草素加入通路抑制劑作為抑制劑組進行后續驗證實驗，以研究木犀草素對NF-κB通路的調控作用。

圖5 各組HeLa 細胞Cyclin D1 和Caspase-3 蛋白表達Western blotting 圖

圖6 各組HeLa 細胞Cyclin D1 mRNA、Caspase-3 mRNA、Cyclin D1 蛋白、Caspase-3 蛋白相對表達量比較（±s，n=3）

3.3 NF-κB抑制劑加劇木犀草素促進HeLa細胞增殖抑制和凋亡 克隆和EdU實驗結果顯示，10 μmol/L木犀草素組細胞增殖率和克隆形成率低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；抑制劑組細胞增殖率和克隆形成率低于10 μmol/L木犀草素組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Hoechst 33258結果表明，10 μmol/L木犀草素組細胞凋亡數高于對照組，抑制劑組細胞凋亡數高于10 μmol/L木犀草素組。（見圖7～10）

圖7 3 組HeLa 細胞EdU 染色圖 （×20）

圖8 3 組HeLa 細胞克隆圖 （×20）

圖9 3 組HeLa 細胞凋亡圖 （×20）

圖10 3 組HeLa 細胞增殖率和克隆形成率比較（±s，n=3）

3.4 NF-κB抑制劑加劇木犀草素對HeLa細胞Cyclin D1和Caspase-3表達的影響 10 μmol/L木犀草素組Cyclin D1 mRNA和Cyclin D1蛋白相對表達量低于對照組，Caspase-3 mRNA和Caspase-3蛋白相對表達量高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；抑制劑組Cyclin D1 mRNA和Cyclin D1蛋白相對表達量低于10 μmol/L木犀草素組，Caspase-3 mRNA 和Caspase-3蛋白相對表達量高于10 μmol/L木犀草素組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（見圖11～12）

圖11 3 組HeLa 細胞Cyclin D1 和Caspase-3 蛋白表達Western blotting 圖

圖12 3 組HeLa 細胞Cyclin D1 mRNA、Caspase-3 mRNA、Cyclin D1 蛋白、Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

3.5 木犀草素抑制HeLa細胞NF-κB通路的活化 3組HeLa細胞NF-κB蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；10 μmol/L木犀草素組HeLa細胞p-NF-κB蛋白相對表達量低于對照組（P＜0.05）；抑制劑組HeLa細胞p-NF-κB蛋白相對表達量低于10 μmol/L木犀草素組（P＜0.05）。（見圖13～14）

圖13 3 組HeLa 細胞NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達Western blotting 圖

圖14 3 組HeLa 細胞NF-κB 和p-NF-κB 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

4 討論

宮頸癌是女性最常見的癌癥之一，防治手段主要是預防和治療高危型HPV宮頸癌感染。宮頸癌的治療以手術為主，可配合放療、化療等方法，但其預后不良，且影響患者術后生活質量[13-14]。木犀草素（3,4,5,7-四羥基黃酮）是一種存在于多種蔬菜、中藥和水果中的一類黃酮類化合物，可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡，對抗人類各種類型的惡性腫瘤[15]，如非小細胞肺癌[16]、胰腺癌[17]和結腸癌[18]等腫瘤。本研究發現木犀草素處理HeLa細胞24 h后，細胞增殖率、克隆形成率明顯降低，細胞凋亡數明顯增多，提示木犀草素可顯著抑制HeLa細胞的增殖，促進其凋亡。Cyclin D1是細胞增殖過程中標志蛋白。作為細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和CDK6的變構調節劑，Cyclin D1可調節從G1期到S期的轉變，Cyclin D1的高表達可促進細胞增殖和腫瘤生長[19]。Caspase-3是執行細胞凋亡的關鍵因子，活化的Caspase-3包含2個p12亞基和2個p17亞基；Caspase-3能利用Cys殘基切割多種底物，調節有絲分裂后神經元（PMN）和神經前體細胞（NPC）中的程序性細胞死亡（PCD），在細胞凋亡中起重要作用[20]。本研究發現，木犀草素處理后，HeLa細胞中Cyclin D1表達水平明顯下調，Caspase-3表達上調，提示木犀草素可能是通過下調Cyclin D1和上調Caspase-3來促進HeLa細胞的凋亡，抑制細胞的增殖。

NF-κB是一類具有多向調節作用的核轉錄因子，靜息狀態下細胞中NF-κB處于未激活、無活性狀態。當細胞被刺激后，磷酸化的NF-κB轉至細胞核與特定靶基因結合調控其轉錄[9]。NF-κB被認為與細胞凋亡及腫瘤的發生發展密切相關，可直接或間接控制癌細胞增殖、存活和抑制抗腫瘤免疫等[21]。有研究表明，木犀草素可通過抑制NF-κB信號通路活化從而抑制骨肉瘤U20S細胞增殖、遷移和上皮間質轉化[22]；人參皂苷Rg3可抑制宮頸癌細胞的體外增殖和轉移能力，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關[23]。但木犀草素是否可以通過NF-κB信號通路影響宮頸癌HeLa細胞的生物學行為尚不明確，因此，本研究在木犀草素基礎上加入NF-κB信號通路抑制劑，探究木犀草素影響宮頸癌細胞增殖和凋亡的作用機制。木犀草素處理后，HeLa細胞p-NF-κB表達水平降低；加入抑制劑后，p-NF-κB表達進一步降低，提示木犀草素可抑制HeLa細胞的NF-κB信號通路，推測木犀草素可能是通過調節NF-κB信號通路來抑制HeLa細胞的增殖并促進凋亡的。這一研究結果與木犀草素干預肺癌[24]和人舌鱗癌[12]的研究結果相符。

綜上所述，木犀草素可顯著抑制HeLa細胞的增殖，促進其凋亡能力，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路有關。本研究為木犀草素治療宮頸癌提供了一定實驗依據，但本研究僅在NF-κB信號通路調控上證明木犀草素與HeLa細胞的增殖、凋亡相關，是否存在其他通路調控該細胞以及是何種基因啟動誘發細胞的增殖和凋亡有待進一步的研究。