基于AEP/PI3K/AKT信號通路探討溫腎散結方對人前列腺癌細胞的調控作用和分子機制*

王田田，朱文靜，盛東亞，聶偉冬，楊 凡，彭 煜

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437）

前列腺癌（prostatic cancer, PCa）是男性泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，好發于老年男性。在歐美國家，PCa發病率已超過肺癌，居于男性常見癌癥發病率的首位[1]。近幾年，我國PCa發病率呈現逐年增長的趨勢[2-3]。由于PCa篩查機制及公眾認知的缺失，多數患者因尿路疼痛或骨痛就診時，疾病已發展到中、晚期階段[4]。晚期PCa易發生骨轉移[5]，骨轉移患者往往會伴隨骨痛、病理性骨折、高鈣血癥等并發癥，且并發癥會導致患者生活質量下降，使總體生存率降低[6]。PCa發病機制目前尚不清楚，盡管采用雄激素剝奪療法（ADT）治療晚期前列腺癌可獲得較好療效，但由于疾病的進展，最終機體會產生抵抗性，導致內分泌治療無效。因此確定新靶點、新通路，并研發新藥物，具有重要意義。

課題組前期實驗已證實了溫腎散結法能有效降低前列腺特異性抗原（PSA）水平，縮小骨轉移灶，延緩前列腺癌進程[7]。“溫腎散結方”（WSSJ方）是全國名老中醫彭培初教授根據多年臨床實踐創制的經驗有效方。前期研究發現，WSSJ方具有抑制激素非依賴性前列腺癌PC3細胞生長、遷移、侵襲及促使其凋亡的作用[8]，然而WSSJ方對具有更強轉移潛能的DU145細胞、激素依賴性前列腺癌22RV1細胞的影響并未探討，且WSSJ方阻礙前列腺癌進展的分子生物學機制尚不清楚。天冬酰胺內肽酶（asparagine endopeptidase, AEP）屬溶酶體半胱氨酸蛋白酶C13家族的成員[9]，在多種惡性腫瘤中呈高表達，且AEP蛋白的高表達與患者的不良預后相關[10]。磷酸酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B, PKB/AKT)信號通路是腫瘤發生的經典信號通路，此信號通路的失調也是引起前列腺癌發生和進展的關鍵機制[11]。前期實驗表明，AEP可通過PI3K/AKT信號通路促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲[12]。因此，本研究基于AEP/PI3K/AKT信號通路探討WSSJ方對人前列腺癌細胞的影響及其分子生物學機制。

1 材料

1.1 主要儀器 細胞培養箱（賽默飛世爾科技有限公司，型號：371）；熒光顯微鏡（徠卡微系統有限公司，型號：DMi8 automated）；超凈臺（青島海爾生物醫療股份有限公司，型號：HR900-ⅡA2）；酶標儀（帝肯貿易有限公司,型號：SPARK）；滅菌鍋（松下電器有限公司，型號：MLS-3781L-PC）；顯影儀（上海安景科技有限公司，型號：ChemiDocTM MP lmaging System）。

1.2 藥物與試劑 溫腎散結方實驗用凍干粉由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥學實驗室制備；RPMI 1640培養基（批號：8121707）、F12培養基（批號：8121751）、胎牛血清（FBS）（批號：Gibco A99G00K）、雙抗（penicillin-streptomycin PS）（批號：Invitrogen 15070063）均購自賽默飛世爾科技有限公司；Cell Counting Kit-8細胞增殖毒性檢測試劑盒（批號：K101822133EF5E）購自美國APE×BIO生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒（批號：P0009）、4%多聚甲醛溶液（批號：P0099-500 mL）及結晶紫染液（批號：C0121-500ml）均購自碧云天公司；AEP多克隆抗體（批號：R24822）、PI3K多克隆抗體（批號：R22768）、AKT多克隆抗體（批號：38117）均購自上海正能生物有限公式；GAPDH（批號：10494-1-AP）購自美國Proteintech Group，Inc；兔熒光二抗（批號：7074）購自美國Cell Signaling Technology公司；反轉錄酶試劑盒（AMV Reverse Trancription Kit M5108）購自美國Promega公司。引物序列委托生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 細胞株 人激素非依賴性前列腺癌PC3細胞株、DU145細胞株由上海中醫藥大學科技創新中心實驗室惠贈；人激素依賴性前列腺癌細胞株22RV1（批號：30423）購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養 PC3細胞用含FBS（10%）和PS（1%）的F12培養基培養，DU145和22RV1使用含FBS（10%）和PS（1%）的RPMI 1 640培養基培養，均在37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養。

2.2 CCK8檢測細胞活力 取對數生長期的前列腺癌細胞PC3、DU145、22RV1，接種到96孔板中，8×103個/孔，每組設置3個復孔。貼壁后，去除原培養基，分別添加含不同濃度WSSJ方的培養基（PC3：0.00、3.13、5.00、6.25、10.00、12.50 mg/mL；DU145：0.00、2.25、3.13、4.50、6.25、9.00 mg/mL；22RV1：0.00、3.13、5.00、6.25、10.00、12.50 mg/mL）處理，其中0.00 mg/mL為對照組。24 h后檢測細胞相對活力，按每孔100 μL培養基中加入10 μL CCK8溶液，并置于細胞培養箱避光孵育2 h，酶標儀在450 nm波長下檢測各孔吸光度值，計算其細胞相對活力。細胞相對活力（%）=[（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）]×100%。

2.3 細胞形態學觀察 取對數生長期的PC3、DU145、22RV1細胞（2×105個/孔），接種于6孔板中，設置對照組、WSSJ方組。貼壁后WSSJ方組更換含藥培養基（5 mg/mL），24 h后顯微鏡下觀察細胞形態并拍照記錄。

2.4 集落形成檢測WSSJ方對細胞增殖能力的影響 取對數生長期的PC3、DU145、22RV1細胞（8×102個/孔）接種至12孔板，設置對照組、WSSJ方低劑量組（0.5 mg/mL）、WSSJ方中劑量組（1.0 mg/mL）、WSSJ方高劑量組（2.0 mg/mL），每3 d更換1次培養液，14 d后，棄培養基，PBS洗3次，多聚甲醛固定15 min；每孔加入0.5 mL結晶紫溶液染色。1 h后棄去染液，用蒸餾水洗滌2次，晾干后觀察并掃描12孔板，記錄結果。

2.5 劃痕實驗檢測WSSJ方對前列腺癌細胞遷移能力的影響 取對數生長期的PC3、DU145細胞（5×105個/孔）接種于6孔板，分組同“2.3”，貼壁后，用100 μL槍頭在6孔板內垂直劃痕，PBS沖洗3次，對照組加入無血清培養基，WSSJ方組更換含藥（5 mg/mL）無血清培養基，繼續培養。按0、6、12、24 h觀察，并拍照記錄，使用Image J分析愈合面積并計算細胞遷移率。遷移率=（0 h劃痕寬度-培養后劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，劃痕寬度平均值=劃痕空隙面積/長度。

2.6 實時熒光定量PCR檢測細胞內AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA表達 取對數生長期PC3、DU145、22RV1細胞，接種于6 cm皿中，分組同“2.3”，待細胞生長密度達到60%時，對照組正常換液，WSSJ方組更換含藥（5 mg/mL）培養基，培養24 h后收集細胞，使用Trizol提取RNA，測純度、濃度，利用PrimeScript RT Master Mix 將RNA 反轉錄為cDNA。根據2×SYBR Green Master Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，模板DNA 1 μL，DEPC水3.6 μL，配制PCR反應體系10 μL，設置3個復孔，上機檢測AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA的表達水平。反應條件設置為95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，40個循環。以GAPDH Ct值為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

2.7 Western blotting 檢測細胞內AEP、PI3K、AKT 蛋白表達 分別取對數生長期的PC3、DU145、22RV1細胞，接種于6 cm皿中，分組及處理同“2.6”，培養24 h后收集細胞，RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min，離心取上清，BCA法進行蛋白定量。變性后配置1 μg/μL蛋白濃度的樣品100 μL，每孔上樣量為10 μL，SDS-PAGE凝膠電泳1 h，200 mA轉至PVD膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，AEP、PI3K、AKT、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入兔二抗，搖床室溫孵育1 h，化學發光法檢測目的條帶，采用Image J軟件對Western blotting條帶進行灰度值定量分析。

2.8 統計學方法 采用GraphPad Prism8及SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料采用“均數±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組人前列腺癌細胞株細胞相對活力比較 PC3細胞：WSSJ方組（3.13、5.00、6.25、10.00、12.50 mg/mL）細胞相對活力明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；DU145細胞：WSSJ方組（3.13、4.50、6.25、9.00 mg/mL）細胞相對活力明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；22RV1細胞：WSSJ方組（6.25、10.00、12.5 mg/mL）細胞相對活力明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。（見圖1）

圖1 各組人前列腺癌細胞株細胞相對活力比較（±s，n=3）

3.2 各組人前列腺癌細胞增殖能力比較 WSSJ方組PC3細胞、DU145細胞、22RV1細胞鏡下計數與細胞融合情況均低于對照組。（見圖2）

圖2 各組PC3、DU145、22RV1 細胞形態比較

3.3 各組人前列腺癌細胞集落形成能力比較 WSSJ方低、中、高劑量組PC3細胞、DU145細胞、22RV1細胞集落形成數量均少于對照組，且集落形成數量隨給藥濃度的升高逐漸減少。（見圖3）

圖3 各組PC3、DU145、22RV1 細胞集落形成比較

3.4 各組人前列腺癌細胞遷移能力比較 WSSJ方組PC3細胞在20、30 h時細胞遷移率明顯低于對照組（P＜0.01）；WSSJ方組DU145細胞在6、12、24 h時細胞遷移率明顯低于對照組（P＜0.01）。（見圖4～5）

圖4 各組PC3、DU145 細胞遷移圖

圖5 各組PC3、DU145 細胞遷移率比較 （±s，n=3）

3.5 各組人前列腺癌細胞AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量比較 WSSJ方組PC3細胞、DU145細胞、22RV1細胞AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖6）

圖6 各組PC3、DU145、22RV1 細胞AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA 相對表達量比較 （±s，n=3）

3.6 各組人前列腺癌細胞內AEP、PI3K、AKT蛋白相對表達量比較 WSSJ方組PC3細胞、AKT相對表達量低于對照組（P＜0.01）；WSSJ方組DU145細胞、22RV1細胞AEP、PI3K蛋白相對表達量均低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖7～8）

圖7 各組PC3、DU145、22RV1 細胞中AEP、PI3K、AKT蛋白表達Western blotting 圖

圖8 各組PC3、DU145、22RV1 細胞AEP、PI3K、AKT 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

4 討論

近年來，全球疾病譜發生了很大的變化，如：惡性腫瘤已成為高收入國家居民的主要死亡原因，并且是心血管疾病（CVD）死亡人數的兩倍[13]。我國前列腺癌發病率呈持續增長趨勢，嚴重影響我國男性居民健康[14]。前列腺癌的主要治療方式包括放療、化療、手術和雄激素剝奪療法[15-17]。雄激素剝奪療法效果雖好，但隨著疾病的進展，機體逐漸產生耐藥性，最終導致治療無應答。中藥治療前列腺癌具有多靶點、多通路、副作用小等特點，在延緩疾病進程、緩解癌癥骨轉移痛、提高患者生存質量方面具有明顯的優勢[18]。姜黃素[19]、槲皮素[20]、五味子甲素[21]等均被證實能夠抑制癌細胞增殖及遷移、促進細胞凋亡。臨床上中藥制劑與西藥聯合應用在延緩癌癥進展、緩解患者癥狀方面已呈現出極大的潛力，國內中醫院普遍應用此方式治療腫瘤[22-23]。盡管如此，中醫藥治療前列腺癌的研究仍處于探索階段，未形成完整體系，尚存在很大的發展空間[24]。

彭培初教授認為前列腺癌的發生、發展與腎相關，疾病早、中期寒、痰、瘀阻滯氣血，邪氣逐漸上升，腎陰耗損，陰虛內熱；晚期邪氣傷正，腎陽虧虛，“腎虛”貫穿疾病的發展始終。故彭培初教授主張從腎論治[25]，早期應滋補腎陰、活血通絡，晚期溫補腎陽、化痰散結，并擬定溫腎散結方。方中重用熟附片、肉桂為君藥，溫腎陽、除積冷、通血脈；三棱、制大黃為臣藥，行瘀通經、破氣散結；麻黃、芥子引陽氣、開寒結，宣通利氣，化痰散結，相得益彰；諸藥合用，共奏溫腎化瘀散結通滯之功。

AEP在乳腺癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤等惡性腫瘤中高表達，且與患者的不良預后相關[10，26-29]。靶向AEP可調控腫瘤細胞的增殖、遷移及凋亡等基本生命進程[30]。PI3K/AKT信號通路是腫瘤相關的經典信號通路，激活PI3K/AKT信號通路會導致癌癥的不良進展[31]。研究表明，PI3K/AKT信號通路在激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC）的發生發展中起重要作用[32]。降低AEP蛋白表達，會減少PI3K、AKT蛋白的表達量[12]；降低AKT信號轉導能夠抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞的增殖[33]。

本研究結果顯示，WSSJ方對人前列腺癌細胞株的細胞相對活力和集落形成能力呈現劑量依賴性抑制，經WSSJ方處理后的前列腺癌細胞遷移能力減弱。WSSJ方組PC3細胞AKT蛋白相對表達量低于對照組，DU145細胞和22RV1細胞AEP、PI3K蛋白相對表達量均低于對照組，且WSSJ方組AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量均低于對照組。綜上所述，靶向AEP蛋白調控PI3K/AKT信號通路，可能是WSSJ方抑制前列腺癌進展的分子機制之一。值得注意的是，本實驗中經溫腎散結方處理的AEP蛋白水平降低，但具有酶活性的AEP蛋白卻被激活。AEP蛋白的酶活性與pH值存在很強的聯系；其在pH值酸性條件下，會進行自體蛋白分解，暴露出具有酶活性的C端，使其成為有催化性質的成熟酶，而在pH值堿性條件下AEP蛋白又會恢復其原酶特性[34]。WSSJ方調控前列腺癌細胞功能的機制是否與AEP蛋白酶活性有關，有待進一步研究。