漢黃芩素對氣虛模型LLC種植瘤小鼠的抗腫瘤作用及淋巴細胞亞群的影響*

毛躍程，邢代君，劉心寧，蔡厚昊，黃國棟，曲泓霖，鄭 心

（1.山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250355；2.青島市中醫醫院，山東 青島 266033）

肺癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，主要發病于肺部支氣管黏膜或腺體，是全球范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。我國肺癌發病率及死亡率居高不下。現代研究[2]證實，腫瘤發生、發展與腫瘤宿主免疫狀況密切相關，細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中起主導作用，而淋巴細胞是人體內主要細胞免疫系統。外周血淋巴細胞（Peripheral blood lymphocyte）主要位于血液循環，該淋巴細胞由T細胞和B細胞組成[3-4]。在機體免疫細胞中，T淋巴細胞是數目最多、最重要的功能細胞，其細胞亞群主要包括CD4+和CD8+T淋巴細胞，這些T淋巴細胞亞群在人體內的比例直接影響免疫功能[5-6]。CD8+T殺傷性淋巴細胞與癌癥患者生存期[7]及對治療反應密切相關[8]。CD4+輔助性T細胞高表達與一些高復發轉移風險預測指標更為相關[9]；調節性T細胞（Treg）為CD4+T淋巴細胞亞群，其動態平衡在維持機體免疫防御、免疫監視方面發揮重要作用[10-11]。自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）與B細胞同樣可殺傷腫瘤，在機體的抗腫瘤免疫反應中同樣具有重要作用[12-13]。

漢黃芩素（Wogonin）來源廣泛，在黃芩、半枝蓮等多種中藥材中均有分布，屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用[14]。研究表明，漢黃芩素能促進人肺癌細胞A549[15]、肝癌細胞HepG2[16]和乳腺癌mcf-7[17]等凋亡，但尚不清楚其是否能通過干預免疫細胞發揮抗腫瘤作用。針對上述問題，本研究采用中醫學傳統病因和現代醫學病因病理造模方法，模擬肺癌患者常見氣虛體質，用煙熏結合種植瘤方法建立肺癌氣虛證病證結合小鼠模型[18]，觀察漢黃芩素的抗腫瘤作用，并探討其作用機制是否與調控各淋巴細胞亞群相關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 SPF級健康雄性C57BL/6小鼠（N型）40只，4～6周齡，體質量16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0006；小鼠飼養環境溫度（25±2）℃，濕度（50±10）%。本研究中所有使用的實驗方案均得到了青島市中醫醫院（市海慈醫院）醫學倫理委員會的批準，批準號：2021HC12LZ036。

LLC小鼠肺癌細胞株，購自大連美侖生物技術有限公司公司。

1.2 藥物與試劑 漢黃芩素（批號：22012106）購自成都普菲德生物技術有限公司；DMEM高糖培養基（批號：MA0212-Mar-18H）、胎牛血清（批號：F0223B）、0.25%胰酶-EDTA（批號：MA0232-Apr-11H）、雙抗-青鏈霉素（批號：MA0110）、細胞凍存液（批號：MA0401）、PBS緩沖液（批號：MA0015-Sep-10G2）均購自大連美侖生物技術有限公司；流式破膜固定液（批號：B360640）、APC780 anti-mouse CD3e 抗體（批號：B349356）、APC anti-mouse Foxp3抗體（批號：B13358685）、APC anti-mouse CD49b抗體（批號：B336797）均購自BIOLEGEND（北京）生物科技有限公司；FITC anti-mouse CD8抗體（批號：2287200）、PE anti -mouse CD25 抗體（批號：2293919）、PE anti-mouse CD19抗體（批號：2376142）均購自賽默飛世爾科技公司；PE-Cy7 anti-mouse CD4抗體（批號：A20334）購自杭州聯科生物技術股份有限公司；紅細胞裂解液（批號：20220105）購自北京索萊寶科技有限公司；紅細胞裂解液（批號：5211106212）購自上海美天旎生物技術貿易有限公司；巴比妥鈉（批號：57-34-2）購自美國SIGMA公司；泰山（華貴）香煙購自中國煙草公司；蘇木精-伊紅染色試劑盒（批號：abs9217）、中性樹膠（批號：abs9177）均購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 Celmate型細胞培養箱（新加坡ESCO公司）；BX61型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；CytoFLEX型流式細胞儀（Beckman Coulter公司）；EG1150C型組織包埋機、RM2235型組織切片機、ST5010型全自動組織切片染色機（德國Leica公司）；BTH-I型攤烘片一體機（山東歐萊博公司）；Sigma1-14型高速冷凍離心機（德國sigma公司）。

1.4 造模與分組

1.4.1 LLC小鼠肺癌細胞培養 LLC小鼠肺癌細胞培養于含10%胎牛血清、1%雙抗-青鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞生長到90%以上時進行傳代培養。

1.4.2 氣虛型LLC種植瘤小鼠模型的制備與分組 用煙熏法建立小鼠氣虛模型[18]，每天10∶00∶00將小鼠放于300 L煙箱內用香煙熏0.5 h（每天暴露2根香煙，每支香煙約燃煙10 min，在每一輪接觸香煙的間隔時間內，讓小鼠休息10 min，以防止二氧化碳引起的窒息），1次/d，連續21 d。在小鼠的常見證候辨證標準[19]中，遲證包括心率緩/遲；食量、飲水量減少；吻、軀體移動減弱。虛證包括老年、發育不良；食量減少、體質量減輕、去瘤體質量減輕、消瘦、羸瘦；吻、軀體移動減弱；精神萎靡、反應遲鈍、倦怠、朦朧欲睡、嗜臥；步態不穩、活動減少、行動呆滯；呼吸微弱、蜷縮、扎堆、拱背；毛蓬松、豎立、無光澤、枯黃、稀少；眼裂變窄/眼瞇/閉目、眼中無神、瞳孔對光反應減弱；肌力減弱；肛門脫垂；垂尾；爪舒展差、蜷縮、伸展無力、白嫩；尾、爪污物附著。遲證、虛證＞1項即可辨證為小鼠氣虛證。無菌條件下，取對數生長的LLC小鼠肺癌細胞，以1×107個/mL重懸于不含血清的DMEM高糖培養基中。將細胞接種于煙熏后氣虛模型小鼠右側腋窩皮下，每只接種約2×106個LLC細胞。造模6 d后進行成瘤評價，于小鼠右側腋下觸及小米大小皮下結節，質硬，活動度一般，邊界清楚，即為造模成功。共有30只小鼠進行造模，造模成功25只。選擇造模成功小鼠24只，按隨機數字表法分為漢黃芩素高劑量組、漢黃芩素中劑量組、漢黃芩素低劑量組、氣虛荷瘤組，每組6只。另取6只正常小鼠作為正常組。

1.5 實驗給藥 漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠分別按25、50、100 mg/kg劑量灌胃給予漢黃芩素混懸液（5 mL/kg），正常組、氣虛荷瘤組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續給藥15d。

1.6 觀察指標

1.6.1 氣虛證小鼠行為狀態表現 煙熏結束后，根據小鼠的常見證候辨證標準[19]觀察小鼠精神狀態、活動度、異常動作及皮毛色澤等多種行為狀態。

1.6.2 小鼠體質量變化及末次給藥后去瘤體質量 從初次給藥前24 h（Day1）開始，每4 d稱量一次小鼠體質量。末次給藥24 h（Day17）后，使用0.3%戊巴比妥鈉溶液以30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠后脫頸椎處死，剝除瘤體，稱量小鼠去瘤體質量。

1.6.3 小鼠腫瘤生長情況及抑瘤率 與稱量小鼠體質量時間節點一致，使用游標卡尺測量腫瘤長徑（A）及與長徑垂直的最大寬徑（B），并計算腫瘤體積。腫瘤體積（V）=AB2/2。剝除瘤體，測量瘤質量，并計算抑瘤率。抑瘤率（TGI）=（氣虛荷瘤組瘤質量-給藥組瘤質量）/氣虛荷瘤組瘤質量×100%。

1.6.4 小鼠脾臟指數、胸腺指數測定 小鼠處死后，取脾臟和胸腺。去除多余脂肪后稱定質量，并計算脾臟指數和胸腺指數。脾臟指數（mg/g）=[脾臟質量（mg）/體質量（g）]×10；胸腺指數（mg/g）=[胸腺質量（mg）/體質量（g）]×10。

1.6.5 小鼠腫瘤、肝臟和腎臟病理形態學觀察 小鼠處死后，取腫瘤、肝臟和腎臟。用4%多聚甲醛固定24 h后，經脫水、包埋、切片，置于自動染色機進行蘇木素-伊紅（HE）染色。待染色結束并晾干后，采用中性樹膠封片，光鏡下觀察、拍照。

1.6.6 小鼠外周血中各免疫細胞計量 采用眼球摘除采血法將血液分別收集于抗凝管中，經紅細胞裂解后，制備得到細胞懸液；再以每管106個細胞分別收集于EP管中。管中同時加入規定劑量的抗體CD3e、CD4、CD25、CD8、CD19、CD49b，混勻后于4 ℃下避光孵育30 min；使用PBS洗滌細胞，進行固定、破膜，破膜后加入抗體Foxp3，混勻后繼續4 ℃避光孵育30 min。孵育完成后使用PBS洗滌細胞，然后重懸于100 μL PBS中。使用流式細胞儀分析輔助性T細胞（CD3+、CD4+、CD8-）、殺傷性T細胞（CD3+、CD4-、CD8+）、調節性T細胞（Treg）（CD3+、CD4+、CD25+、Foxp3+）、NK細胞（CD3-、CD49b+）和B細胞（CD3-、CD19+）所占比例。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示；數據滿足正態分布與方差齊性檢驗時采用單因素方差分析，否則采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，重復測量數據比較采用重復測量方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。統計圖采用GraphPad Prism9.0軟件進行繪制。

2 結果

2.1 小鼠一般情況 煙熏造模結束后，正常（未煙熏）小鼠無撞擊、瞇眼、蜷臥等行為，活動度活躍，皮毛光亮，精神狀態正常，飲食量正常；煙熏小鼠煙熏時有跳躍、撞擊表現，喜蜷臥，活動度減弱，毛發脫落且蓬松凌亂，毛色發灰，欠光澤，精神萎靡，飲食量較未煙熏小鼠下降。在小鼠的常見證候辨證[19]中，煙熏后小鼠符合氣虛證體質表現。（見圖1）

圖1 小鼠一般情況

2.2 各組小鼠體質量比較 所有小鼠隨時間推移體質量均有增加，差異有統計學意義（P＜0.001），即存在時間效應。各組小鼠體質量總體比較，差異無統計學意義（P=0.104），即不存在分組效應；各組小鼠于給藥前（Day1）、給藥第4天（Day5）、給藥第12天（Day13）、末次給藥24 h（Day17）體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；給藥第8天（Day9），氣虛荷瘤組小鼠體質量高于正常組（P＜0.05），漢黃芩素中、高劑量組小鼠體質量均低于氣虛荷瘤組（P＜0.05）。隨時間推移，各組小鼠間體質量增長幅度不一致（P=0.007），即時間因素與分組因素間存在交互效應。（見表1、圖2）5組小鼠給藥結束后去瘤體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖3）

表1 各組小鼠體質量比較 （±s，g）

表1 各組小鼠體質量比較 （±s，g）

注：F時間主效應=455.272，P時間主效應=0.000；F分組主效應=2.144，P分組主效應=0.104；F交互效應=2.282，P交互效應=0.007；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與氣虛荷瘤組比較，cP＜0.05。

組別n給藥劑量/[mg/(kg/d）]Day1Day5Day9Day13Day17FP正常組6-17.88±0.62 20.21±0.59 23.59±0.50 24.79±1.59 24.93±1.60 71.545 0.000氣虛荷瘤組6-17.24±0.50 22.20±0.59 26.06±1.29b 26.65±1.28 27.28±1.96 127.608 0.000漢黃芩素低劑量組 62517.39±1.06 21.51±2.34 24.57±2.50 25.55±2.90 26.79±1.76 93.716 0.000漢黃芩素中劑量組 65017.10±0.53 21.31±0.72 24.72±1.02c 25.31±1.33 25.97±1.57 93.095 0.000漢黃芩素高劑量組 610017.46±0.89 22.33±2.10 24.57±1.75c 25.17±1.83 25.85±2.08 78.065 0.000 F 1.6382.6494.0411.8881.749 P 0.1950.0560.0110.1430.170

圖2 各組小鼠體質量交互效應輪廓圖

圖3 各組小鼠給藥結束后去瘤體質量比較 （±s，n=6）

2.3 各組小鼠瘤體體積及抑瘤率比較 所有小鼠瘤體體積隨時間推移均增大，差異有統計學意義（P＜0.001），即存在時間效應。各組小鼠瘤體積總體比較，差異有統計學意義（P＜0.001），即存在分組效應；給藥前（Day1），各組小鼠瘤體體積比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；給藥第4天（Day5），漢黃芩素高劑量組小鼠瘤體體積明顯低于氣虛荷瘤組（P＜0.05）；給藥第8天（Day9）、給藥第12天（Day13）、末次給藥24 h（Day17），漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠瘤體體積均明顯低于氣虛荷瘤組（P＜0.01）。隨時間推移，各組小鼠間瘤體體積增長幅度不一致（P=0.022），即時間因素與分組因素間存在交互效應。（見表2、圖4～5）與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組瘤體質量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。漢黃芩素低、中、高劑量組抑瘤率分別為55.68%、56.84%、76.33%。（見圖6）

表2 各組小鼠瘤體體積比較 （±s，mm3）

表2 各組小鼠瘤體體積比較 （±s，mm3）

注：F時間主效應=27.043，P時間主效應=0.000；F分組主效應=10.769，P分組主效應=0.000；F交互效應=2.227，P交互效應=0.022；與氣虛荷瘤組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別n給藥劑量/[mg/(kg·d)] Day1Day5Day9Day13Day17FP氣虛荷瘤組6-33.34±10.41 101.73±30.36 393.337±153.61 1 317.17±547.47 2 004.29±954.34 36.355 0.000漢黃芩素低劑量組62532.89±15.99 68.35±32.39 141.07±75.66b297.35±169.49b708.82±160.39b 2.981 0.049漢黃芩素中劑量組65032.30±11.07 55.81±10.10 96.72±40.70b297.17±86.36b553.79±377.64b 3.912 0.020漢黃芩素高劑量組610032.37±6.3537.82±11.39a 74.11±19.50b179.17±52.83b347.14±98.94b0.975 0.447 F 0.5461.8905.3369.69011.975 P 0.6560.1640.0070.0000.000

圖4 各組小鼠瘤體體積交互效應輪廓圖

圖5 各組小鼠瘤體大體觀察圖

圖6 各組小鼠瘤體質量比較 （±s，n=6）

2.4 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠脾臟指數明顯升高（P＜0.05），胸腺指數明顯降低（P＜0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠脾臟、胸腺指數與氣虛荷瘤組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖7）

圖7 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較 （±s，n=6）

2.5 各組小鼠腫瘤及肝臟、腎臟組織病理變化 氣虛荷瘤組小鼠腫瘤組織細胞排列緊密，大小不一，細胞核染色深且形狀各異；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織可見較多處壞死區域，且腫瘤細胞的排列相對紊亂。（見圖8）

圖8 各組小鼠的腫瘤組織病理切片圖 （HE）

正常組、氣虛荷瘤組及漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠肝臟組織的肝細胞索間界限清晰，肝小葉結構清晰，胞漿界限明顯，未見明顯異常；腎臟組織的腎小球、腎小管等結構清晰完整，無明顯水腫及血管擴張充血等病變。（見圖9）

圖9 各組小鼠的肝臟、腎臟病理切片圖 （HE，×400）

2.6 各組小鼠外周血輔助性T細胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3+CD4+T細胞比例明顯降低（P＜0.05）；與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD4+T細胞比例均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組間小鼠外周血CD3+CD4+T細胞比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖10～11）

圖10 各組小鼠外周血輔助性T 細胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖11 各組小鼠外周血輔助性T 細胞亞群部分流式細胞圖

2.7 各組小鼠外周血殺傷性T細胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3+CD8+T細胞比例明顯降低（P＜0.01）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD8+T細胞比例與氣虛荷瘤組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖12～13）

圖12 各組小鼠外周血殺傷性T 細胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖13 各組小鼠殺傷性T 細胞亞群部分流式細胞圖

2.8 各組小鼠外周血CD4+/CD8+比值比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD4+/CD8+比值明顯降低（P＜0.01）；與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD4+/CD8+比值均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組間小鼠外周血CD4+/CD8+比值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖14）

圖14 各組小鼠外周血CD4+/CD8+比值比較 （±s，n=6）

2.9 各組小鼠外周血調節性T細胞（Treg）（Treg）亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例明顯降低（P＜0.01）；與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；漢黃芩素低、中、高劑量組間鼠外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖15～16）

圖15 各組小鼠外周血調節性T 細胞（Treg）亞群比例比較（±s，n=6）

圖16 各組小鼠外周血調節性T 細胞（Treg）亞群部分流式細胞圖

2.10 各組小鼠外周血B淋巴細胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3-CD19+B細胞比例明顯降低（P＜0.01）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3-CD19+B細胞比例與氣虛荷瘤組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖17～18）

圖17 各組小鼠外周血B 淋巴細胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖18 各組小鼠外周血B 淋巴細胞亞群部分流式細胞圖

2.11 各組小鼠外周血中NK細胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3-CD49b+NK細胞比例有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3-CD49b+NK細胞比例與氣虛荷瘤組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖19～20）

圖19 各組小鼠外周血NK淋巴細胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖20 各組小鼠外周血NK 淋巴細胞亞群部分流式細胞圖

3 討論

在中國，肺癌是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[20]。在過去40年間，中國肺癌的死亡率增加約4倍，取代了胃癌成為癌癥死亡的最主要原因[21]。目前研究發現，肺癌的發生、發展與環境污染、吸煙、職業接觸、電離輻射等多種因素有關，而自身的免疫狀態更與其有著十分密切的聯系[1]。肺癌患者體內免疫功能抑制或紊亂可導致腫瘤細胞逃脫免疫細胞的“監測”而“逃逸”，這不僅會使腫瘤細胞的惡性增殖不受控制，而且會大大增加腫瘤細胞轉移的風險性[22-23]。因此，監測肺癌患者免疫功能的動態變化對于選擇合適的治療方案及預測肺癌患者預后的意義十分重大。

中醫學認為肺癌的基本病機在于正氣虧虛。本病病位在肺，吸煙、肺部基礎疾病等可導致肺陰虧虛、易感外邪，正氣不足而邪毒滯于體內，內外因相互作用引起氣機阻滯、臟腑失調，血液運行不暢形成瘀血，而痰熱瘀毒聚于肺腑，共結為癌毒[24]。正如李中梓在《醫宗必讀》中所說：“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之。”本研究采用煙熏法以造模氣虛型小鼠[18]，后采用皮下接種LLC肺癌細胞制備小鼠種植瘤模型，模擬肺癌發生、發展的全過程。

漢黃芩素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于黃芩、半枝蓮等中藥材，肝毒性和腎毒性均較低。本研究采用皮下接種LLC肺癌細胞制備小鼠種植瘤模型，以此探討漢黃芩素的抗肺癌作用以及其作用機制是否與調控各淋巴細胞亞群相關。從瘤體體積、瘤體質量及瘤組織的病理檢查結果來看，漢黃芩素干預能夠減緩腫瘤的生長，與漢黃芩素的抗腫瘤活性相關研究結果[25-26]一致。現代醫學認為，脾臟和胸腺是重要的免疫器官，是衡量機體免疫能力的重要指標[27]。脾臟是機體最大的免疫器官，既是T細胞和B細胞定居的場所，也是免疫應答發生的場所。腫瘤會引起脾臟的腫大，而腫大的脾臟會導致白細胞明顯減少，嚴重影響機體正常的免疫功能[28]。T細胞的發育是由骨髓來源的淋巴樣祖細胞和支持性胸腺基質微環境之間的相互作用協調的。而胸腺功能的下降則會導致抗腫瘤免疫功能受損，延遲癌癥患者的免疫重建[29]。在癌癥治療中，更好的全身免疫狀態意味著可以更持續的從外周血中募集抗腫瘤淋巴細胞，對于癌癥治療具有更好的意義[30]。T淋巴細胞亞群作為檢測機體細胞免疫功能的重要指標之一，其對于某些疾病的診斷、分析發病機制、療效觀察及預后的預測均具有重要臨床價值[31]。作為抗腫瘤免疫的一個重要組成部分，外周血CD4+T細胞有助于調節和促進細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的啟動、遷移潛力和殺傷活性[32]。臨床研究發現，對于晚期非小細胞肺癌患者，更高水平的CD4+T細胞與更好的療效及更長的PFS相關[33]。CD4+T細胞亞群在識別免疫治療前臨床受益者，預測免疫治療效果和患者存活率方面有很大價值[34]。與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠CD4+T細胞水平較高，這說明漢黃芩素可增加CD4+T細胞數量，從而獲得更持久的抗腫瘤反應。CD8+T細胞可以擴增分化成CTL，通過血液循環遷移浸潤腫瘤以直接殺傷腫瘤細胞，在抗腫瘤免疫中發揮重要作用[35]，所以高CD8+T細胞水平可以增強抗腫瘤反應。然而有臨床試驗[33-36]顯示，免疫治療有效組的外周血CD8+T細胞比例較基線組有所降低，故CD8+T細胞比例水平與抗腫瘤免疫可能與多種因素有關。CD4+/CD8+比值可以顯示機體免疫功能的狀態，是癌癥患者細胞介導免疫的標志，其降低提示機體處于免疫抑制狀態，可能誘發或加快腫瘤生長[37-38]。與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD4+/CD8+比值明顯升高，說明漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠的免疫抑制狀態得到了明顯改善。調節性T細胞（Treg）是以免疫抑制功能為特征的CD4+T細胞譜系，具有維持機體免疫穩態、免疫監視和預防自身免疫的作用[39]，對于預防所有組織的破壞性免疫至關重要[10]。與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血中調節性T細胞（Treg）比例明顯增加，與臨床研究[33]所顯示的晚期非小細胞肺癌患者免疫治療臨床受益組的外周血調節性T細胞（Treg）較基線有所增加相符合，所以漢黃芩素對于LLC種植瘤小鼠外周血調節性T細胞（Treg）的升高作用可能具有積極意義。B細胞通過抗原呈遞激活T細胞，外周血B細胞的比例下降，表明體液免疫受損[40]。然而，多項研究[41]表明，激活的B細胞的細胞毒性具有導致腫瘤發展的潛在危害，如B細胞介導抑制活化CD8+T細胞，促進晚期非小細胞肺癌細胞生長等[42]。NK細胞在腫瘤免疫檢測中具有積極作用，臨床研究證實，免疫治療臨床受益組外周血中NK細胞比例較基線有所增加，且基線NK細胞的比例越高，則臨床療效越好，患者更有可能獲得更長的FPS[33,43-44]；NK細胞的活性也可作為生物標志物來預測非小細胞肺癌患者對于免疫治療的反應程度[45]。

綜上所述，在氣虛型LLC種植瘤小鼠模型上，漢黃芩素可以有效抑制種植瘤的生長，提高外周血中CD4+T淋巴細胞的比例，提高CD4+/CD8+T細胞的比值，改善免疫狀態，從而更好地發揮免疫系統的抗腫瘤作用。本研究結果可為將漢黃芩素開發為抗腫瘤免疫治療藥物提供參考，但漢黃芩素作用于淋巴細胞的機制尚不明確，這仍需要進一步的研究。