血清miR-935和miR-22-3p水平與小兒支氣管哮喘嚴重程度的相關性分析

徐玉娟,何秀,李勝濤,譚潭（湖南省郴州市第一人民醫院,湖南 郴州 423000）

兒童支氣管哮喘的早期診斷和病情嚴重程度評估有助于改善預后，盡管臨床癥狀結合兒童較難配合完成的肺功能檢查和臨床常規白細胞、C-反應蛋白等炎癥指標在一定程度上基本能夠完成其輔助診斷和病情評估，但仍有近1/3患兒無法得到早期的明確診斷，使其成為了一項挑戰[1]。既往研究[2]發現，對細胞轉錄和靶基因表達具有調控作用的微小RNA（micro-RNA，miRNA）在支氣管哮喘的發生和發展中發揮著重要作用。目前關于血清miR-935和miR-22-3p在小兒支氣管哮喘患者中的表達水平及其與患者病情嚴重程度相關性的研究報道甚少，故本研究旨在通過檢測小兒支氣管哮喘患者發作時血清miR-935和miR-22-3p的水平變化，分析其與病情嚴重程度的相關性，以期為小兒支氣管哮喘患者的臨床病情評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將50例于2021年6月-2022年12月在我院診治的支氣管哮喘急性發作患兒作為觀察組研究對象，其中男孩27例，女孩23例，年齡0-12歲，平均年齡（5.24±3.09）歲。另選取同期50例來院健康體檢兒童作為對照組，其中男孩25例，女孩25例，年齡6-14歲，平均年齡（5.2±3.15）歲。觀察組患兒根據病情嚴重程度分為輕度組（n=17）、中度組（n=18）和重度組（n=15），各組兒童在性別、年齡等資料方面無統計學差異（P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會審批通過。

納入標準：①首次發病且未接受過規范化哮喘治療的0歲≤年齡≤12歲兒童；②支氣管哮喘及病情評估參照《支氣管哮喘基層診療指南（實踐版·2018）》[3]；③兒童家屬知情并同意本次研究。排除標準：①有其他肺部疾病如感染性肺炎、肺氣腫、支氣管擴張等；②肝、腎、心等其他系統受損者；③近一周服用過激素類藥物患兒。

1.2 研究方法 體檢兒童在體檢當天、觀察組患兒在接受治療前，均空腹狀態抽取外周靜脈血3mL，離心后立即吸取分離后的血清分裝凍存在-80℃冰箱內。采用第二代測序技術將獲得的支氣管哮喘患兒血清進行miRNA差異表達譜檢測分析，初步篩查數具有差異表達的血清miR-935和miR-22-3p作為下一步生物信息學分析的標志物并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術進行驗證。通過查閱文獻[4-5]并設計PCR引物序列如下：miR-935正向引物（F）：5′-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTTACCGCTTC CGC-3′，反向引物（R）：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miR-22-3p F：5′-CATTCAGCCAGTCTCCACGTGA-3′，R：5′-G C T T C C A G T G A T A C G G C C T G T A C G-3′；內參U 6 F：5′-C T C G C T T C G G C A C G A C A-3′，R：5′-A A C G C T T C A G A A T T G C G T-3′。采用由1 0 u l TaqManGEMASTERMix、1ul產物、1ul引物和8ul無RNA酶水組成的20ul反應體系經過95℃ 5min，95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 20s共40循環的擴增過程進行RT-qPCR反應，再根據內參基因U6的表達量計算出ΔCt值，以2-ΔΔCt值作為目標基因產物表達水平。比較兩組兒童及不同病情患兒血清miR-935和miR-22-3p水平的表達差異。

1.3 統計學分析 采用SPSS28.0軟件進行數據分析。定量資料用(±s)表示，多組間行方差分析，兩組間行t檢驗。診斷價值分析采用繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）。P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童血清miR-935和miR-22-3p水平比較 觀察組患兒血清miR-935表達水平明顯高于對照組，而血清miR-22-3p表達水平呈相反趨勢，兩組間比較，具有統計學意義（t=4.786和5.975，P均＜0.001），見表1。

表1 兩組兒童血清miR-935和miR-22-3p水平比較

2.2 不同病情患兒血清miR-935和miR-22-3p水平比較 輕度組、中度組和重度組患兒血清miR-935表達水平呈遞增趨勢，而血清miR-22-3p表達水平呈相反趨勢，組間和組內比較，具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同病情患兒血清miR-935和miR-22-3p水平比較

2.3 血清miR-935和miR-22-3p對兒童支氣管哮喘的診斷價值 繪制ROC曲線分析發現：血清miR-935、miR-22-3p及兩者聯合對兒童支氣管哮喘的診斷曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.772、0.785和0.825，診斷靈敏度為72.25%、75.00%和82.25%，診斷特異性為75.00%、77.25%和85.00%。

3 討論

在兒童中發病率占3%左右且有上升趨勢的支氣管哮喘的發生與家族遺傳、環境影響和免疫功能降低等多種因素相關，若未得到及時有效的治療，可誘發氣道狹窄，miRNA表達異常相關的體內調節機制研究或可為支氣管哮喘的病情嚴重程度評估和通過靶基因尋找新的治療方式提供科學依據[6-8]。

既往關于miR-935和miR-22-3p的研究大多集中在腫瘤和自身免疫性疾病，其可通過對白介素相關信號通路、絲裂原激活蛋白激酶和細胞外基質的調控而發揮生物學作用[9-12]。本研究發現，觀察組患兒血清miR-935表達水平明顯高于對照組，而血清miR-22-3p表達水平呈相反趨勢（P＜0.05），輕度組、中度組和重度組患兒血清miR-935表達水平呈遞增趨勢（P＜0.05），而血清miR-22-3p表達水平呈相反趨勢（P＜0.05），ROC曲線顯示血清miR-935、miR-22-3p及兩者聯合對兒童支氣管哮喘具有較高的診斷敏感性和特異性，表明血清miR-935在支氣管哮喘患兒中表達升高，而血清miR-22-3p表達降低，其水平的變化與疾病嚴重程度相關，對支氣管哮喘具有一定的診斷價值，這可能與miRNA調控不同信號通路而影響細胞因子表達從而在不同哮喘類型中發揮作用有關，可進行進一步的研究，或有望為靶向治療及探尋新型生物學標志物作出貢獻[13]。