高效液相色譜法測定氯嘧磺隆類似物的水解半衰期

梁黃冰，權維燕，王明良

（1.中國熱帶農業科學院 農產品加工研究所，廣東 湛江 524001；2.廣東醫科大學 海洋醫藥研究院，廣東 湛江 524023；3.深圳大學 化學與環境工程學院，廣東 深圳 518060）

磺酰脲類除草劑是一類作用獨特的除草劑［1］，具有用量少、高效、殺草譜廣、對人畜低毒性等優點，被廣泛應用于水稻、小麥、大豆等田間雜草的防控［2］，在全球使用量很大［3］。一些磺酰脲類除草劑雖具有高效的除草活性，但在土壤中的殘留持續時間較長，會對后茬農作物造成嚴重的藥害［4-5］。因此，對于新型磺酰脲類除草劑的研發，除了考慮高活性，還需關注其是否具有適宜的降解速率，以免對后茬作物產生殘毒。

氯嘧磺隆是商品化使用較多的超高效磺酰脲類除草劑，但在環境中降解較慢。本文以氯嘧磺隆為基礎，制備了氯嘧磺隆類似物A：3-（4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基）-1-（2-甲氧羰基苯基）磺酰脲，B：3-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基）-1-（2-甲氧羰基-4-氨基苯基）磺酰脲，采用高效液相色譜法測定氯嘧磺隆類似物的水解特性，為開發藥殘留少、對環境更加友好的新型除草劑提供指導。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

儀器：LC2000高效液相色譜儀，四元梯度泵，可變波長紫外-可見光檢測器（上海天美有限公司）；色譜柱，C18（250mm×?4.6 mm，5μm），美國安捷倫公司；BSA224S-CW 電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；UV-2501PC紫外可見分光光度計（日本島津公司）；pH 計 （FE20-FiveEasy Plus，METTLER TOLEDO）。

試劑：氯嘧磺隆類似物A和B樣品（本實驗室自制，w＞95%），甲醇、冰乙酸、無水硫酸鈉、磷酸（色譜純，中國上海阿拉丁試劑公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×?4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水 （體積比60∶40，水用磷酸調至pH＝3）；柱溫：30℃；流速：1.0mL／min；檢測波長：230 nm；進樣量：20μL。

1.2.2 標準工作曲線的制備

分別各準確稱取25 mg氯嘧磺隆類似物A和B樣品于燒杯中，加入適量甲醇超聲溶解，轉移到250 mL容量瓶中定容即得標樣母液。依次取3、6、12、24、48 mL母液至100 mL容量瓶中，稀釋定容得質量濃度分別為3、6、12、24、48 mg／L的標準溶液。將上述配制好的標準溶液在給定的色譜條件下進樣，以峰面積對質量濃度進行回歸得標準工作曲線［6］。

1.2.3 緩沖溶液的配制

①稱取16.4 g（0.20mol）乙酸鈉，加水超聲溶解后，定容至1000 mL，配制成0.2 mol／L的乙酸鈉水溶液。

②稱取6 g（0.10mol）乙酸，加水用超聲波溶解后，定容至500 mL，配制成0.2 mol／L的乙酸水溶液。

③將乙酸鈉溶液和乙酸溶液以7∶3（體積比）的比例混合，再用精密pH計檢測調成pH＝5的緩沖溶液，密封保存，待用。

1.2.4 樣品的水解動力學測定

分別準確稱取7.5 mg氯嘧磺隆類似物A和B樣品于燒杯中，加少量甲醇，超聲溶解，轉移至250 mL的棕色容量瓶中。用pH＝5的緩沖溶液定容，并繼續超聲溶解，得到樣品溶液。用4.5μm微孔濾膜過濾后，立即測定其起始質量濃度，然后將剩余樣品溶液于恒溫箱中25℃避光保存（排除光降解影響），每間隔一定的時間取樣，測定其殘留量，每次測定都重復3次取平均值，以殘留量對取樣時間做圖，計算化合物在pH＝5緩沖液中的水解半衰期［7］。

1.2.5 定量方法

按氯嘧磺隆類似物的HPLC保留時間及外標峰面積法進行定量［8］。計算公式為：

式中，R為樣品中農藥殘留量（mg／kg）；S樣注入樣品溶液的峰面積；ρ標標準溶液質量濃度（mg／L）；V終樣品溶液最終定容體積（mL）；S標注入標準溶液的峰面積；m樣品質量（g）。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將氯嘧磺隆類似物A和B的甲醇溶液在200～400 nm的波長范圍內進行掃描，其吸收光譜如圖1所示。

圖1 氯嘧磺隆類似物A和B的甲醇溶液紫外吸收光譜圖

由圖1看出，兩個化合物的最大吸收峰在220～250 nm范圍內。吸收面積隨檢測波長的增加而減少，當檢測波長較小時，雜質和溶劑也有很多的吸收，樣品、溶劑和雜質等分離不完全；而檢測波長較大時，雜質的干擾少，但是同樣濃度下響應值過小而達不到分析要求［9］。本實驗研究選擇230 nm作為檢測波長，在該波長處樣品響應值高，雜質干擾較小，符合農藥殘留分析的基本要求。

2.2 流動相的選擇

對于流動相的選擇，有機相主要考慮甲醇或者乙腈，對甲醇和水以及乙腈和水作為流動相進行分離度考察。結果顯示，它們的分離度都可達農藥殘留分析基本要求。但后者毒性較大，且成本較高，故使用毒性較小，成本較低的甲醇。另外，由于磺酰脲類除草劑大部分呈弱酸性，在酸性的條件下是以分子形態存在，而在中性或者堿性以陰離子和兩性離子的形態存在［10-11］，實驗表明，流動相中的水用磷酸調成酸性水（pH＝3.0），色譜峰型得到改善，目標峰也與雜質峰很好地分離。但酸性過強時，會導致基線不穩定和縮短色譜柱的壽命［12］。

本實驗以甲醇和酸性水（pH＝3.0）為流動相，在一定色譜條件下流動相中甲醇體積分數在60% ～70%范圍內，考察了其對保留時間和分離的影響，結果見表1。試驗表明，在一定范圍內，樣品的保留時間隨著甲醇比例的減小而增大：比例過大時，保留時間過短；比例過小時，保留時間過長。氯嘧磺隆類似物A在甲醇-酸性水體積比為65∶35時的保留時間為8.6min，B在甲醇-酸性水體積比為60∶40時的保留時間為7.3min。兩者的保留時間都在7 min以上，能有效地與保留時間較小的雜質峰分離開，故氯嘧磺隆類似物A和B的流動相體積比分別確定為65∶35，60∶40。

表1 氯嘧磺隆類似物在不同流動相下的保留時間min

2.3 流動相流速的選擇

分別考察了流動相流速為0.5、1.0和1.5mL／min下色譜的出峰情況：流速較大時，出峰較早，但雜質峰對主峰干擾嚴重，分離度降低；流速較小時，分離度升高，但保留時間延長，影響實驗進度。綜合考慮后，選擇1.0mL／min作為流動相流速。

2.4 標準工作曲線

圖2和圖3是氯嘧磺隆類似物A和B的標準工作曲線。從圖2、圖3看出，在3～48 mg／L范圍內，氯嘧磺隆類似物的色譜峰面積與質量濃度具有良好的線性關系，相關系數都大于0.999，符合定量分析的要求。回歸方程分別為A：y＝32.82x+7.491，R2＝0.9995，B：y＝41.42x+11.679，R2＝0.9999。

圖2 氯嘧磺隆類似物A的標準工作曲線

圖3 氯嘧磺隆類似物B的標準工作曲線

2.5 水解動力學

氯嘧磺隆類似物A和B在25℃、pH＝5時的水解動力學曲線如圖4和圖5所示。相應的水解動力學方程、水解速率常數和水解半衰期見表2。在pH＝5的緩沖溶液體系中，氯嘧磺隆類似物的水解符合一級反應動力學方程，可以用公式ρt＝ρ0e-kt描述。其中，k為水解速率常數，t為反應時間，ρ0為初始質量濃度，ρt為時間的質量濃度。此公式變形為一級反應速率常數，即k＝ln 2／T1／2，T1／2為水解半衰期。因此，依據公式可計算出水解半衰期和水解速率常數［13］。

表2 氯嘧磺隆類似物的水解動力學參數

圖4 氯嘧磺隆類似物A的水解曲線

圖5 氯嘧磺隆類似物B的水解曲線

由圖4和圖5的水解曲線和表2的水解動力學參數看出，無光照條件下，在pH＝5的緩沖溶液中，氯嘧磺隆類似物A和B樣品溶液的質量濃度ρt均隨著時間的增加而不斷下降，且水解的相關系數R2分別為0.972和0.901，擬合度較好，故質量濃度與時間之間的關系遵循一級動力學規律。

據文獻報道，氯嘧磺隆在pH＝5的環境下水解的半衰期為22.21 d［14-15］。本實驗所得的氯嘧磺隆類似物A的水解半衰期為15.57 d，與氯嘧磺隆的相近。氯嘧磺隆類似物B的水解半衰期為8.45 d，表明該氯嘧磺隆類似物有較好的水解特性，對環境更友好，具有較好的應用潛力。

2.6 水解過程的色譜圖

氯嘧磺隆類似物A的水解過程液相色譜圖見圖6。主體化合物的峰在8.4min出現，2～5min是雜質或水解產物峰。氯嘧磺隆類似物B的水解過程液相色譜圖見圖7。主體化合物的峰在6.8min出現，2～4min是雜質或水解產物峰。從兩者的色譜圖看出，實驗所用的色譜條件能有效地將主體化合物與雜質分開，且主體化合物色譜的峰型對稱性較好。

圖6 氯嘧磺隆類似物A的水解色譜圖

圖7 新型除草劑B水解的色譜圖

比較兩種氯嘧磺隆類似物水解前、水解中期的色譜曲線可以發現，氯嘧磺隆類似物A的主體化合物峰（8.4min）的高度從45降為25，雜質或水解產物峰（5min）的高度從8增加到13。氯嘧磺隆類似物B的主體化合物峰（6.8min）的高度從29降為17，雜質或水解產物峰（3.6min）的高度從4增加到17。即隨著水解時間的延長，主體化合物減少，雜質或水解產物增加。

3 結論

確定了檢測波長、流動相成分、流動相流速等高效液相色譜法的基本條件。水解動力學研究表明，氯嘧磺隆類似物A的水解半衰期為15.57 d，與氯嘧磺隆的相近。而氯嘧磺隆類似物B的水解半衰期為8.45 d，降解性能優良，具有較好的應用潛力。