胡蜂酒薄層色譜和高效液相色譜法指紋圖譜研究*

陸禮和，田先嬌，田素梅，馬艷粉，郭云膠，楊新周，3**

（1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.德宏師范高等專科學(xué)校 民族醫(yī)藥研究所，云南 芒市 678400；3.德宏師范高等專科學(xué)校 理工學(xué)院，云南 芒市 678400）

胡蜂酒來(lái)源于景頗民族醫(yī)藥，由德宏州瑞麗人梅干家族發(fā)明［1］，自1977年以來(lái)一直收錄在《中華人民共和國(guó)藥典》中。胡蜂酒不僅可以祛除風(fēng)濕、治療急性風(fēng)濕病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而且對(duì)治療肩周炎、坐骨神經(jīng)痛、四肢麻木、跌打損傷都有一定的療效；用法上不僅可以口服，還可以外用［2］。胡蜂酒承載著民族文化和歷史的文化。目前對(duì)胡蜂酒的研究主要集中在制作工藝上，對(duì)胡蜂酒中薄層色譜和液相指紋圖譜鮮見(jiàn)報(bào)道。

《中華人民共和國(guó)藥典》中主要記載了胡蜂酒的制法、性狀，檢查項(xiàng)目主要包括pH、乙醇量、總固體物、其他酒劑有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定、功能主治、用法用量等［2］。目前僅有彭增榮對(duì)胡蜂酒進(jìn)行了初步的鑒別［3］，郭云膠等研究了胡蜂酒的配制方法［4］，而對(duì)于胡蜂酒指紋圖譜方面的研究較少。

指紋圖譜作為較為完善的藥材評(píng)價(jià)體系，主要分為色譜、光譜和分子指紋圖譜等［5-8］。薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）是鑒別中藥材的常用方法之一，具有簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)［9-10］，廣泛用于中藥材的鑒別、質(zhì)量控制［11-17］。液相色譜作為目前應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)，具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［5-8］，已廣泛用于動(dòng)植物成分分析與鑒別應(yīng)用中［18-25］。本研究以胡蜂酒為研究對(duì)象，通過(guò)高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）建立指紋圖譜并進(jìn)行分析，旨在為胡蜂酒的開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

實(shí)驗(yàn)用純水為UPR-II優(yōu)普超純水機(jī)所制超純水。乙腈、甲酸（色譜純），異硫氰酸苯酯（PITC），三乙胺等其他試劑均為分析純。螞蟻酒（昆明野象谷生物工程開(kāi)發(fā)有限公司，36%）、蝎子酒（山東蒙山釀酒釀酒有限公司，35%）、蛇酒（永州市異蛇科技有限公司，32%）。

胡蜂收集于云南不同地區(qū)，經(jīng)德宏師專郭云膠教授鑒定為胡蜂科金環(huán)胡蜂（Vespa mandarinia Smith）。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Ultimate 3000，賽默飛世爾公司）。

1.3 方法

1.3.1 胡蜂酒的制作

按照2020版藥典，稱取100 g鮮胡蜂，加入1000mL白酒，浸泡20 d以上，得胡蜂酒。

1.3.2 薄層色譜鑒定

取胡蜂酒溶液14批，按照薄層色譜法（中國(guó)藥典通則0502）試驗(yàn)，吸取14批胡蜂酒溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以正丁醇-甲酸（體積比50∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃烘至呈現(xiàn)斑點(diǎn)清晰。

1.3.3 HPLC指紋圖譜研究

1）色譜條件。色譜柱：AgilentC18柱（?4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢 測(cè) 波 長(zhǎng)：254 nm；流 動(dòng) 相：（A）0.1mol／L乙酸鈉（用乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）-（B）乙腈，梯度見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2）供試品溶液的制備。精密移取胡蜂酒2mL，置圓底燒瓶中，60℃ 減壓濃縮干燥，殘?jiān)?.1mol／L鹽酸溶液10mL溶解，搖勻，備用；精密量取上述供試品溶液各5mL，分別置25mL量瓶中，各加0.1mol／L異硫氰酸苯酯 （PITC）的乙腈溶液2.5mL，1mol／L三乙胺的乙腈溶液2.5mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10mL，加正己烷10mL，振搖，放置10min，取下層溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3）測(cè)定法。分別精密吸取衍生化后的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 胡蜂酒薄層色譜圖

不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒薄層色譜圖見(jiàn)圖1。其中0號(hào)為白酒，1～14號(hào)樣品為胡蜂酒，從圖1中看出，胡蜂酒薄層色譜分離度好，斑點(diǎn)清晰。薄層色譜主要為氨基酸薄層色譜，可用于鑒別胡蜂酒。

圖1 胡蜂酒薄層色譜圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 樣品色譜圖

2.2.1 精密度試驗(yàn)

取同一份胡蜂酒樣品 （S1），按 “1.3.3中2）項(xiàng)”制備供試液品，按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜，以16號(hào)色譜峰為參照，其它各個(gè)峰與其比較獲得相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.38%，相對(duì)保留峰面積RSD≤0.41%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取胡蜂酒樣品（S1），按“1.3.3中2）項(xiàng)”制備供試液品，按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、24、48 h進(jìn)樣，以12號(hào)色譜峰為參照，其它各個(gè)峰與其比較獲得相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.45%，相對(duì)保留峰面積RSD≤0.81%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取胡蜂酒樣品（S1），按“1.3.3中2）項(xiàng)”平行制備供試液品6份，按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)試，檢測(cè)指紋圖譜，以12號(hào)色譜峰為參照，其它各個(gè)峰與其比較獲得相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.45%，相對(duì)保留峰面積RSD≤0.81%，表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

2.3 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取14批胡蜂酒樣品溶液，按“1.3.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2017版）”，設(shè)定參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正及譜峰自動(dòng)匹配，生成14批樣品的HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖3。共確定19個(gè)共有峰（見(jiàn)圖2）。

圖3 14批次胡蜂酒的HPLC指紋圖譜

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2017版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。14批胡蜂酒樣品的相似度在0.946以上，說(shuō)明不同產(chǎn)地的胡蜂酒樣品間的化學(xué)成分差異較小。

表3 14批次胡蜂酒的HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4 胡蜂酒與其他類型酒的圖譜

用同樣的方法制備HFJ（胡蜂酒）、SJ（蛇酒）、XZJ（蝎子酒）、MYJ（螞蟻酒）樣品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)試，色譜圖見(jiàn)圖4。從圖4中看出，4種動(dòng)物酒HPLC圖譜既有相似的色譜峰，也存在不同的色譜峰。在16～24min之間，蛇酒未出現(xiàn)色譜峰，蝎子酒出現(xiàn)了一個(gè)微弱的色譜峰，螞蟻酒出現(xiàn)色譜峰與胡蜂酒相似，但強(qiáng)度較低，通過(guò)液相色譜可以將胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、螞蟻酒進(jìn)行區(qū)分辨別。導(dǎo)致4種動(dòng)物酒出現(xiàn)差異可能是化學(xué)成分種類和含量之間存在差異。

圖4 胡蜂酒與其他動(dòng)物酒的HPLC圖譜

2.5 聚類分析

以14個(gè)不同產(chǎn)區(qū)，共有色譜峰峰面積進(jìn)行聚類分析，可將胡蜂酒分為4類。第一類包括S2、S3、S5、S10、S6、S1、S4、S9、S11、S13，第二類包括S7，第三類包括S12、S14，第四類包括S8（見(jiàn)圖5）。

圖5 胡蜂酒峰面積聚類分析

2.6 主成分分析

結(jié)合胡蜂酒液相色譜圖共有峰峰面積相關(guān)系數(shù)矩陣，計(jì)算該矩陣的特征值和方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果見(jiàn)表4。確定了4個(gè)主成分，其中，第1、2、3、4主成分對(duì)總方差的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到 42.947%、21.263%、13.235%、8.742%。所有研究指標(biāo)提供信息的85.917%能被前4個(gè)主成分反映出來(lái)，達(dá)到了對(duì)不同產(chǎn)地胡蜂酒中共有峰指標(biāo)評(píng)價(jià)的降維目的。

表4 相關(guān)系數(shù)特征值和方差貢獻(xiàn)率

將14個(gè)不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒中19個(gè)共有峰峰面積指標(biāo)進(jìn)行因子分析，從而對(duì)不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒共有峰峰面積指標(biāo)進(jìn)行降維處理。進(jìn)一步求出矩陣的特征值、特征向量、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率（表4）。初始因子載荷矩陣、載荷圖如表5及圖6。從表5和圖6中看出，第1主成分與共有峰G1、G2、G3、G5、G10、G11、G12、G13、G15呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)。第2主成分與共有峰4、6、7、9、14、16、17、18呈正相關(guān)，第3主成分與共有峰19呈正相關(guān)，第4主成分與共有峰G1、G2呈正相關(guān)。根據(jù)19個(gè)共有峰在不同因子上的載荷，可確定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18與胡蜂酒色譜峰主成分1、2、3、4關(guān)聯(lián)較強(qiáng)。

圖6 因子載荷圖

表5 初始因子載荷矩陣

3 結(jié)論

本研究以不同產(chǎn)地胡蜂酒為研究對(duì)象，以正丁醇-甲酸作為展開(kāi)系統(tǒng)，茚三酮試液為顯色劑，建立了胡蜂酒的氨基酸薄層色譜；通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，胡蜂酒薄層色譜分離度好，斑點(diǎn)清晰，可用于鑒別胡蜂酒。在液相色譜條件 （Agilent C18（?4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，乙腈-0.1mol／L醋酸鈉溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30℃）下，建立了HPLC指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行相似度分析。對(duì)共有色譜峰進(jìn)行聚類分析，可將胡蜂酒分為4類。以胡蜂酒液相色譜圖共有峰峰面積相關(guān)系數(shù)矩陣，計(jì)算該矩陣的特征值和方差貢獻(xiàn)率，確定了4個(gè)主成分，根據(jù)19個(gè)共有峰在不同因子上的載荷，可確定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18與胡蜂酒色譜峰主成分1、2、3、4關(guān)聯(lián)較強(qiáng)。通過(guò)液相色譜專屬性分析，可將胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、螞蟻酒進(jìn)行區(qū)分辨別。通過(guò)建立的胡蜂酒的TLC鑒別方法和HPLC指紋圖譜，兩種方法簡(jiǎn)單、可靠，可用于胡蜂酒的鑒別和質(zhì)量控制。