盧婭玲，史 娟，陳 貴

（貴州省黔南州檢驗檢測院，貴州 都勻 558000）

金烏骨通膠囊由金毛狗脊、淫羊藿、威靈仙、烏梢蛇、土牛膝等10味藥組成，具有滋補肝腎、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效，用于肝腎不足、風(fēng)寒濕痹、骨質(zhì)增生、骨質(zhì)疏松引起的腰腿酸痛、肢體麻木等癥狀［1］。目前，金烏骨通膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中缺少對土牛膝的質(zhì)量控制。處方中土牛膝，在民間特別是少數(shù)民族中的應(yīng)用非常廣泛，但各省級地方標(biāo)準(zhǔn)收載的土牛膝植物基原有所不同。在貴州、湖南的中藥材標(biāo)準(zhǔn)中，基原與中國藥典四部通則所載土牛膝基原是一致的［2］。《中華人民共和國藥典》2020版四部通則規(guī)定，土牛膝的植物來源為莧科植物粗毛牛膝（Achyranthesaspera L.）的干燥根及根莖［3］，具有活血散瘀、清熱解毒、祛濕利尿等功效［4］。土牛膝主要含β-蛻皮甾酮、齊墩果酸等成分。因金烏骨通膠囊中木瓜也含有齊墩果酸，陰性會對檢測有干擾，故而不選擇齊墩果酸作為鑒別指標(biāo)。實驗擬采用β-蛻皮甾酮對照品和土牛膝對照藥材對金烏骨通膠囊中土牛膝進行定性鑒別，結(jié)果表明，建立的以土牛膝對照藥材為對照的TLC方法可應(yīng)用于金烏骨通膠囊及土牛膝原藥材的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AG135型電子天平、AL204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK250LHC型超聲儀（上海科導(dǎo)公司）。

1.2 材料

β-蛻皮甾酮對照品（批號111638-201907）、土牛膝對照藥材（批號121610-201302），均購于中國食品藥品檢定研究院；狗脊、烏梢蛇、葛根、淫羊藿、木瓜、姜黃、威靈仙等陰性對照用飲片，均購于都勻市湘君大藥房，土牛膝、土黨參、補骨脂藥材由貴州盛世龍方制藥有限公司提供，經(jīng)鑒定為正品；試劑均為分析純。15批次金烏骨通膠囊和5批次土牛膝原藥材樣品信息見表1。

表1 金烏骨通膠囊及土牛膝原藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品提取方法的考察

實驗考察了下列幾種樣品提取方法：①取本品20粒內(nèi)容物，加65%乙醇50mL，超聲處理30min，過濾；濾液蒸干，殘渣加水30mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次30mL，棄去三氯甲烷液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL；合并正丁醇液，加氨試液洗滌2次，每次30mL，棄去氨試液，繼續(xù)用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇10mL使溶解，作為供試品。②取本品40粒內(nèi)容物，加水50mL，回流30min，過濾；濾液用乙醚振搖提取2次，每次5mL；棄去乙醚液，水溶液用正丁醇10mL振搖提取，分取正丁醇液，濃縮至約2mL，作為供試品溶液。③取本品10粒內(nèi)容物，加乙醚40mL，加熱回流20min，過濾；取藥渣，揮盡乙醚，加70%乙醇60mL，加熱回流1 h，放冷，過濾；濾液中加入鹽酸2mL，加熱回流1 h，濃縮至約5mL，加水10mL，用石油醚（60～90℃）振搖提取2次，每次20mL；合并石油醚液，回收溶劑至干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。

實驗結(jié)果：方法②③主斑點未能清晰顯現(xiàn)。方法①主斑點清晰，薄層色譜圖譜展距適中，故選擇方法①為供試品的提取方法。

2.2 各溶液的制備

2.2.1 金烏骨通膠囊供試溶液的制備

取本品20粒內(nèi)容物，加65%乙醇50mL，超聲處理30min，過濾；濾液蒸干，殘渣加水30mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次30mL；棄去三氯甲烷液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL；合并正丁醇液，加氨試液洗滌2次，每次30mL；棄去氨試液，繼用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇10mL使溶解，即得。

2.2.2 土牛膝原藥材供試溶液制備

取土牛膝原藥材2.4 g，同“2.2.1”項下方法制備原藥材供試溶液。

2.2.3 土牛膝對照藥材溶液的制備

同“2.2.2”項下方法。

2.2.4 缺土牛膝陰性對照溶液的制備

按金烏骨通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方和制法制備缺土牛膝的陰性對照樣品，并取適量，照“2.2.1”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 不同展開系統(tǒng)的考察

供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液各取6μL，分別點于同一高效硅膠H薄層板上。分別在①三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比10∶45∶22∶10）；②三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨水試液（體積比50∶20∶10∶2.5）；③乙酸乙酯-乙醇（體積比4∶1）；④環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（體積比20∶5∶8）中展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。

結(jié)果：系統(tǒng)①主斑點清晰，分離度良好。系統(tǒng)②③④樣品主斑點不清晰，分離度差，故選擇系統(tǒng)①為展開系統(tǒng)。

2.4 方法耐用性考察

2.4.1 樣品點樣量的考察

按提取方法①制成供試品溶液，分別取供試品2、4、5、6、8、10μL，點于同一高效硅膠H板上。以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 （體積比10∶45∶22∶10）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果供試品溶液點樣量以6μL效果最佳。故點樣體積選擇為6μL。

2.4.2 溫濕度的考察

進 行 了 低 溫 （4℃）、室 溫 （25℃）、高 溫（40℃），低濕度（30%）、中等濕度（50%）、高濕度（80%）的考察。在不同溫度和不同相對濕度條件下，樣品和土牛膝對照藥材均主斑點清晰，分離度良好。

2.4.3 薄層板的考察

考察了不同類型薄層板：高效硅膠H、高效硅膠G、硅膠H、硅膠G，結(jié)果表明，高效硅膠H板分離效果最好，故選擇高效硅膠H板。

2.4.4 顯色劑的考察

考察了5%香草醛硫酸溶液和10%的硫酸乙醇溶液兩種顯色劑，結(jié)果以10%的硫酸乙醇為顯色劑斑點不清晰，顯色不明顯。以5%硫酸乙醇為顯色劑斑點顯色清晰。故選擇5%香草醛硫酸溶液為顯色劑。

2.5 鑒別方法

照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各6μL，分別點于同一高效硅膠H薄層板上。以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 （體積比10∶45∶22∶10）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。

2.6 專屬性試驗

取“2.2”項下各溶液，照“2.5”項下方法試驗，結(jié)果TLC圖譜中主斑點清晰，陰性無干擾。TLC圖見圖1。

圖1 金烏骨通膠囊中土牛膝鑒別專屬性試驗TLC圖

2.7 樣品檢測結(jié)果

15批次金烏骨通膠囊和5批次土牛膝原藥材色譜中，在與土牛膝對照藥材相應(yīng)的位置上，均顯示相同顏色的主斑點。TLC鑒別圖見圖2和圖3。

圖2 金烏骨通膠囊中土牛膝TLC鑒別圖

圖3土牛膝原藥材TLC鑒別圖

3 討論

土牛膝主含β-蛻皮甾酮、齊墩果酸等成分，因金烏骨通膠囊中木瓜也含有齊墩果酸，陰性會對檢測有干擾，故而不選擇齊墩果酸作為鑒別指標(biāo)。在以β-蛻皮甾酮作為TLC鑒別指標(biāo)的研究過程中，采用幾種提取和顯色方法，金烏骨通膠囊樣品均未檢出β-蛻皮甾酮。按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的處方和制法制備含土牛膝的樣品，對土牛膝原藥材和制備樣品進行TLC鑒別，結(jié)果原藥材檢出，而制備樣品未檢出，說明β-蛻皮甾酮可能在生產(chǎn)過程中發(fā)生反應(yīng)而損失，不能作為金烏骨通膠囊中土牛膝的鑒別指標(biāo)。本文所建立的薄層色譜方法在與土牛膝對照藥材相同的位置顯相同顏色的主斑點，展距適中，分離度良好，溫濕度對結(jié)果影響較小結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性較好。

本文建立的TLC鑒別方法專屬性強，可應(yīng)用于土牛膝原藥材及金烏骨通膠囊的質(zhì)量控制。