高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肌肉中尼卡巴嗪、地克珠利和托曲珠利的主要代謝物殘留量

◎宋佳盛，李 彤，李勝南，劉貴銘，牛瑩瑩，劉鳳海

（牡丹江醫學院 公共衛生學院，黑龍江 牡丹江 157011）

尼卡巴嗪屬于二硝基類抗球蟲藥，是4,4-二硝基均二苯脲（DNC）和α-羥基-4,6-二甲基嘧啶（HDP）復合物，主要用于預防雞柔嫩艾美耳球蟲和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球蟲，尼卡巴嗪進入動物體內HDP排泄迅速，DNC排泄緩慢起主要抗球蟲作用[1]。地克珠利和托曲珠利是均三嗪類的高效、廣譜、的抗球蟲藥，可有效預防和治療雞、兔、羊和豬等禽畜艾美耳寄生蟲病。其中，地克珠利進入動物體內不易分解，主要以原體抑蟲，而托曲珠利在動物體內可快速磺化成為妥曲珠利砜，起到抗球蟲作用。二硝基類和均三嗪類抗球蟲藥具有較強的治療效果，但由于其半衰期較短，頻繁用藥導致食品中藥物代謝物殘留增加影響食品安全，危害人體健康。歐盟和中國均頒布食品安全標準，對雞肌肉、皮和脂肪及肝、腎中這3種抗球蟲藥物代謝物最大殘留限量做了明確的規定[2]。因此，使用時應嚴格按照用法用量，并遵守停藥期，以避免食品中超標殘留。

抗球蟲藥代謝物殘留量的檢測方法有免疫法[3]、液相法[4]、液質聯用法[5]法，其中，免疫分析法往往需要制作相應復雜的抗體，存在準確率不高等缺點。液相色譜法儀器操作簡單，可以同時檢測多種抗球蟲藥物，但靈敏度僅能達到1 ug/kg。液相色譜-串聯質譜法是國家標準檢測方法中推薦的首選方法，靈敏度高可達1 ng/kg，檢出限低，完全能夠滿足實際需要[6]。實驗采集不同地區雞肌肉樣品，選用液相色譜-串聯質譜法對樣品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利的代謝物殘留量分析，結果令人滿意。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

尼卡巴嗪（4,4-二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利砜（北京TMstandard科技股份有限公司）、乙腈、甲醇，其余所用試劑均為分析純，水為超純水，現用現制。

AB SCIEX 4500型三重四極桿質譜儀（AB SCIEX公司 美國）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（Thermo公司 美國）；204E型電子天平（METTLER TOLEDO公司 德國）；QC10260超聲清洗儀（天津旗美公司）；4型渦旋混合器（IKA公司 德國）；3-18型高速冷凍離心機（Sigma公司 德國）；PureLab Classic超純水器（ELGA公司 英國）。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備液

稱取尼卡巴嗪（以4,4二硝基均二苯脲計）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標準品約10 mg（精確至0.1 mg，按純度值折算）。用甲醇溶解并定容至10 mL，標準儲備溶液質量銥度為1 000 mg/L。-20 ℃以下避光貯存，保存期為12個月。

1.2.2 標準中間液

分別準確量取100 μL尼卡巴嗪（4,4二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標準儲備液，用甲醇稀釋至10 ml ，質量濃度為10 mg/L的標準中間液，-20 ℃避光保存，180 d內有效。

1.2.3 內標標準使用液Ⅰ

分別準確量取100 μL托曲珠利-d3溶液，用甲醇稀釋為10 mL,質量濃度為1 mg/L的標準中間液，-20 ℃避光保存，180 d內有效。

1.2.4 內標標準使用液Ⅱ

準確內標標準使用液Ⅰ1 mL ，用乙腈定容至10 mL，標準使用液質量濃度為0.1 mg/L，4 ℃貯存，保存期為30 d。

1.2.5 標準使用液

配制系列標準溶液，目標化合物濃度分別為0.2 μg/L、0.5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L，內標濃度為5 μg/L。

1.3 試樣制備

選取200 g用均質器混合均勻，-4 ℃以下保存備用。稱取均質試樣2.00 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，準確加入50 uL內標標準使用液Ⅰ，加入2 mL水渦旋混勻，再加入10 mL乙腈，旋渦混合30 s超聲提取20 min。10 000 r/min離心10 min（-5 ℃)。在15 mL離心管內加入250 mg DSC-18和2 g無水硫酸鈉，再加上述上清6 mL，轉速9 000 r/min 離心時間5 min，最后取上清液1 mL用于HPLCMS/MS測定。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱Kinetex F5 C18（Phenomenex 美國），50 mmx3 mm、2.6 μm；柱溫設置20 ℃；進樣量5 μL；流動相：A 水，B 乙腈。液相色譜梯度洗脫條件表見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件表

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源：離子源溫度為500 ℃；毛細管電壓為5.5 kV；脫溶劑氣溫度為550 ℃；脫溶劑氣流量為40 psi ；掃描模式：多離子反應監測模式（MRM )。其它質譜參數表見表2。

表2 目標化合物的質譜分析參數表

2 結果

2.1 提取過程的優化

2.1.1 選取提取溶劑

選擇正己烷、乙腈、三氯甲烷、二甲基亞砜和丙酮等5種有機溶劑對雞肉和雞蛋中地克珠利進行提取，發現提取效率分別為98.4%、80.9%、76.3%、69.6%、57.7%。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取溫度的選擇

選擇5、0、-5 ℃低溫冷凍條件下樣品提取，提取效率分別為99.2%、97.4%和92.3%，選擇-5 ℃作為提取溫度。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 流動相的選擇

使用甲醇-水和乙腈-水2種流動相，對托曲珠利和內標物進行分離。由圖1可以看到，使用乙腈-水作為流動相時，目標物的信號強度更高，干擾信號更低。因此，選擇乙腈-水作為最佳流動相。

圖1 乙腈-水位流動相時托曲珠利和內標物的色譜圖

2.2.2 流動相組成比例的影響

對比流動相乙腈-水中乙腈比例分別為60%、80%、100%時分離效果，發現乙腈比例增大，目標色譜峰出峰變快，響應信號強。見圖2。

圖2 流動相中不同比例乙腈-水對保留時間的影響結果圖

2.2.3 流速的影響

為了研究流速對分離效果的影響，比較了300、350、400 μL/min 3種不同流速下的實驗結果。實驗表明，在流速降低時，保留時間延長，峰高和峰面積增加，分離效果更好。因此，選擇了300 μL/min作為最佳流速。

2.2.4 柱溫的影響

在20、30、40 ℃三種不同的柱溫下，對50 mg/L的尼卡巴嗪標準溶液進行了分離。結果顯示，在溫度升高的情況下，峰面積沒有明顯變化，但是出峰時間具有顯著差異。在30 ℃和40 ℃時，尼卡巴嗪的出峰時間都比20 ℃時快很多。因此，選擇了30 ℃作為最佳柱溫。

2.3 質譜條件優化

將濃度均為100 μg/L尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標準品直接進樣，通過碰撞能量、去簇電壓等條件優化，建立質譜參數。尼卡巴嗪選擇136和107作為定量和定性離子，地克珠利選擇333和222.9作為定量和定性離子，托曲珠利砜選擇399和147.8作為定量和定性離子，托曲珠利母離子不易形成碎片，分子離子選擇424.2。

2.4 標準曲線、檢出限和定量限

以目標組分峰面積與內標的峰面積之比為縱軸，標準工作液的質量濃度ρ（μg/L）為橫軸，繪出標準曲線，見表3。

表3 3種抗球蟲藥主要代謝物殘留量的標準曲線、檢出限和定量限表

2.5 精密度和準確度

對地產雞肉、雞蛋樣品進行采樣后進行精密度、回收率實驗。稱取雞肉或雞蛋 200 g，按上述制樣方法制取待測溶液6份，計算出相對標準偏差（RSD）并對精密度評價。結果如下：尼卡巴嗪RSD為2.04%，回收率87.5%~109%；地克珠利RSD為1.93%，回收率95.7%~107%；托曲珠利RSD為1.39%，回收率97.2%~106%；托曲珠利砜RSD為1.63%，回收率92.6%~101%。

2.6 實際樣品分析

在黑龍江省6個城市采集雞肉66份、雞蛋66份，使用該方法檢測其中抗球蟲類藥物，結果發現，雞肉和雞蛋樣品中尼卡巴嗪、地克珠利含量均＜0.1 μg/L，托曲珠利、托曲珠利砜均＜1.0 μg/L，表明，黑龍江省的雞肉和雞蛋中3種抗球蟲藥物的食品風險很低。

3 結語

通過對黑龍江省部分城市的雞肉和雞蛋樣品中抗球蟲類藥物殘留量的檢測，結果樣品中均未檢出，符合國家標準食品中獸藥最大殘留限量的要求。在優化實驗條件和性能評價后，超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜法可對雞肉和雞蛋中3種抗球蟲藥殘留量進行有效測定，方法靈敏、準確、可靠，可以作為食品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利和托曲珠利砜的檢測方法。