發酵法提取覆盆子黃酮的研究

蔣曉蕊 許 巖 李 婷 曹寶帥 張李莉 范桂強 孫金旭

（1 衡水市質量與標準化研究院 河北 衡水 053000；2 衡水市綜合檢驗檢測中心 河北 衡水 053000； 3 衡水學院 河北 衡水 053000）

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，2015 年國家衛計委把覆盆子列為藥食同源食品。藥用覆盆子為覆盆子未成熟果實，經采摘熱燙后，干燥而成。覆盆子具有多種功能性成分，如黃酮類化合物、多酚類物質、鞣花酸、生物堿、有機酸、甾醇等[1，2]。研究證明，覆盆子入膀胱經，覆盆子提取物和活性成分具有抗氧化、防癌抗癌、抗老化、溫腎補腎、預防心腦血管疾病等功效[3～5]。黃酮類化合物為覆盆子中的主要功能成分，具有重要的作用。藥物中提取黃酮的方法很多，發酵法提取功能成分，微生物在發酵生長過程中會產生很多種酶如纖維素酶、蛋白酶等，這些酶對植物細胞破壁起到關鍵性作用，有利于提高提取率。本研究旨在以覆盆子為原料，利用發酵法提取覆盆子中的黃酮類物質，為工業提取提供支持，有利于覆盆子黃酮的藥物應用。

1 材料與方法

1.1 材料。覆盆子(北京同仁堂衡水分店)經清洗后，烘干，粉碎機粉碎后過80 目篩；蘆丁標準品(購于國家標準物質網)，菌種(衡水學院生命科學系菌種室保藏)。

1.2 儀器設備。破壁機(深圳市凈品環保科技有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；分光光度計(722G 可見分光光度計廣州廣一科學儀器有限公司)；發酵桶8 L(特百惠食品級)。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制。準確的稱取蘆丁標準品10 mg，用60%的乙醇溶解后轉入100 ml 的容量瓶中定容，搖勻，得到100 mg/L 的蘆丁標準品溶液。

1.3.2 繪制標準曲線。用移液槍準確的量取蘆丁標準液0、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，加入到比色管中，依次添加濃度為5%的NaNO21 ml，搖勻后，靜置10 min，添加10%的硝酸鋁1 ml，搖勻后靜置10 min，添加10%的氫氧化鈉溶液10 ml，搖勻后用60%的乙醇溶液添加至刻度線，搖勻后，510 nm 測定吸光度值。以測定的吸光度值為縱坐標，蘆丁的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，分析得到回歸方程：A=0.0137C-0.052，R2=0.997。

1.3.3 覆盆子黃酮測定。取經發酵提取過濾后的覆盆子黃酮提取液20 ml，用濃度為60%的乙醇溶液稀釋至50 ml 后，按蘆丁標準液處理方法處理后測定吸光度值。

2 結果與分析

2.1 菌種對發酵法提取覆盆子黃酮的影響。菌種不同，代謝途徑不同，產生的酶不同，對粉碎后的覆盆子細胞壁破壞程度不同，提取效果也不同。根據參考文獻資料報道，分別選取枯草芽孢桿菌、黑曲霉、安琪酵母、木醋桿菌、乳酸菌作為發酵菌，普通提取作為對照，研究菌種對發酵法提取覆盆子黃酮的影響，結果如圖1 所示。由圖1 分析可知，發酵法提取較普通提取，雖然使用的菌種不同，但都能提高覆盆子黃酮的提取率，菌種不同產生的酶系不同，破壁提取的效果不同。相比之下，使用安琪酵母作為菌種，覆盆子黃酮的提取量達到29.65 mg/g，相對普通水提，提取率提高最大，其它雖然也有提高，但提取率增加不大，因此，安琪酵母作為發酵提取菌種較為適宜。

圖1 菌種對發酵提取的影響

2.2 料液比例對發酵法提取覆盆子黃酮的影響研究。根據報道，料液比例對提取活性成分也會產生很大的影響，適宜的料液比例會有利于破壁提取，分別設定料液比例為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，經處理后，安琪酵母按照1.0%的接種量接種，培養發酵時間為24 h，發酵培養結束后，過濾殺菌后測定黃酮含量，結果如圖2 所示。由圖2 可知，料液比例對發酵法提取覆盆子黃酮影響較大，隨著料液比例的增大(溶液濃度的降低)，覆盆子黃酮提取量逐漸增加，當料液比例為1∶20時，發酵法提取覆盆子黃酮的提取量最大，之后隨料液比例的增加，覆盆子黃酮提取量有所降低，表明料液比例1∶20 較為適宜，具體原因有待于進一步分析。

圖2 料液比例對發酵提取的影響

2.3 接種量對發酵法提取覆盆子黃酮的影響。處理后的覆盆子，按照1∶20 的料液比例，經煮沸滅菌，降溫后按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的接種量接種安琪酵母，經發酵培養24 h 后測定覆盆子黃酮提取量，結果如圖3 所示。接種量不同，也就是發酵初始的發酵液中菌種數量不同，覆盆子黃酮提取量不同。低接種量，菌量增加較慢，高接種量，菌之間會產生競爭抑制，所以需要尋找適宜的接種量。經測定分析，安琪酵母接種量為2%時，覆盆子黃酮提取量最高，確定2%為安琪酵母適宜接種量。

圖3 接種量對發酵提取的影響

2.4 發酵時間對發酵法黃酮提取量的影響。經處理后的覆盆子，按1∶20 的料液比例，經煮沸滅菌，自然降溫至28 ℃，安琪酵母接種量2%，發酵液每8 h 取樣測定1 次，結果如圖4 所示。發酵時間不同，菌種的代謝產物差別較大，隨著發酵時間的延長，覆盆子黃酮提取量逐漸增加，當發酵時間為36 h 時，覆盆子黃酮提取量最大，因此確定發酵時間以36 h 較為適宜。

圖4 發酵時間對發酵提取的影響

2.5 普通提取與發酵提取覆盆子黃酮對比分析。優化后的發酵法提取覆盆子黃酮與普通熱浸提覆盆子黃酮對比分析如圖5 所示。對比分析可知，優化后發酵法提取覆盆子黃酮提取量達到42.36 mg/g，普通熱水浸提覆盆子黃酮提取量為17.30 mg/g，優化后的發酵法提取覆盆子黃酮相對普通提取提高144.86%，表明發酵法提取覆盆子黃酮是非常行之有效的提取方法。

圖5 發酵法與普通法對比分析

3 結論與討論

利用發酵法和普通法對比提取覆盆子黃酮，對發酵法提取從菌種選擇、料液比例、接種量、發酵時間進行優化研究，優化后的發酵法提取覆盆子黃酮提取工藝為：菌種選擇安琪酵母，料液比例1∶20，接種量2%，發酵時間36 h，此條件下覆盆子黃酮提取量為42.36 mg/g，相對于普通熱浸提提高144.86%，菌在發酵生長過程中能產生大量多種多樣的酶，這些酶對植物細胞壁破壁作用效果明顯。表明發酵法提取覆盆子黃酮是行之有效的提取方法。