三棱標準湯劑指紋圖譜及含量測定研究

吳銳華，譚素嫻，盧國揚，杜藹媚

國藥集團德眾（佛山）藥業有限公司，廣東 佛山 528000

三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖。三棱性平，味辛、苦，歸肝、脾經，具消積止痛、行氣破血的功效，臨床上可用于治療食積脹痛、癥瘕痞塊、瘀血經閉、痛經等病癥［1］。

三棱所含有的化學成分比較復雜，主要有黃酮類、揮發油類、生物堿類、有機酸類、苯丙素類，對人體有不同藥物功效。除此之外，還含有少量蒽醌、甾體等化學成分［2-8］。三棱在抑制血小板聚集所導致的血栓、對抗炎癥、緩解疼痛、抗擊腫瘤等方面均可發揮一定藥理作用［2-8］。

為促進中藥研究標準化，對中藥飲片標準湯劑的研究顯得至關重要，其不僅有助于制劑工藝進步，而且還可以提升藥物質量，為中藥配方顆粒制備、研發和質量控制提供相關的理論依據［9］。

本研究是在前人對三棱藥材研究的基礎上，鑒于三棱標準湯劑為水煎煮而得，脂溶性成分較難轉移，建立一套基于超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜和指標成分含量測定的三棱標準湯劑質量評價方法［10-12］。

1 實驗材料

電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，SQP 型，精度分別為0.1 mg 和0.01 mg］；超聲儀（東莞市大朗速潔超聲設備制造廠，DC400）；電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司，DK-98-Ⅱ）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，KA-1000）；旋轉蒸發儀（鞏義予華儀器有限公司，YRE-301）；超高速液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司，UPLC Vanquish）。

甲醇（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；乙醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；冰醋酸（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；香草酸（批號：110776-201503，含量99.8%，中國食品藥品檢定研究院）；阿魏酸（批號：110773-201614，含量99.6%，中國食品藥品檢定研究院）；對香豆酸（批號18011605，含量99.97%，成都普菲德生物科技有限公司）；香草醛（批號20120820，國藥集團化學試劑有限公司）。

15 批三棱飲片，購自浙江、江西、安徽和湖南等地，根據《中國藥典》2020 版三棱標準進行檢驗，全部符合藥典標準。見表1。

表1 15批三棱飲片的產地信息表

2 方法與結果

2.1 三棱飲片標準湯劑的制備

依照2016 年國家藥典委員會發布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）》制備標準湯劑。取150 g 三棱飲片，置電加熱陶瓷壺中，加適量水分兩次煎煮，首次煎煮加入藥材重量9 倍量的水，浸泡30 min 后，先用武火（500 W）將藥液煮沸，再用文火（200 W）使其微沸，時間為30 min，之后使用200 目篩網過濾煎液，濾液置于密閉容器中保存并用冷水冷卻。第二次煎煮加入藥材重量7 倍量的水，先用武火（500 W）將藥液煮沸，再用文火（200 W）使之維持微沸25 min，用200 目篩網，趁熱過濾煎液，濾液轉移至密閉容器中并用冷水冷卻。合并兩次煎液并將其轉移至圓底燒瓶中，在低溫條件下采用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮（真空度為-0.08 MPa～-0.1 MPa；溫度為60 ℃），轉速50～90 r/min，濃縮至約150 mL。濃縮液在磁力攪拌下，吸取2 mL 均勻分裝于10 mL棕色西林瓶中，置冷凍真空干燥機中進行干燥，取出，軋上鋁蓋，即得。

2.2 指紋圖譜的研究

2.2.1色譜條件色譜柱：Waters CORTECS T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，93% B；2～10 min，93% →87% B；10～17 min，87% →67% B；17～25 min，67%→60% B）；檢測波長：300 nm；流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL；柱溫：35 ℃，每次運行完后預平衡5 min。

2.2.2對照品溶液的制備分別精密稱取香草酸、香草醛、對香豆酸和阿魏酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取三棱標準湯劑凍干粉，研至細粉狀，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇15 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4精密度試驗將同一供試品溶液連續進行6 次，所得數據顯示標準湯劑各色譜峰以對香豆酸為參照的相對保留時間RSD 值均在0.2%以內，相對峰面積的RSD 值均在3.0%以下，表明儀器精密度良好。

2.2.5重復性試驗按“2.2.3”項下的操作方法，同時制備六份供試品溶液并進行檢測和計算，數據顯示各色譜峰以對香豆酸為參照的相對保留時間RSD值均不超過0.2%，相對峰面積的RSD 值均在3.0%以下，表明此方法的重復性良好。

2.2.6穩定性試驗取同一份三棱標準湯劑供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、24 h 進樣，對其進行檢測分析，計算結果顯示以對香豆酸為參照的相對保留時間RSD 值在0.2%以內，相對峰面積的RSD 值則均在2.0%以下，表明供試品在24 h內穩定。

2.2.7指紋圖譜的建立依照“2.2.3”項下方法，制備15 批三棱標準湯劑供試品溶液并使用UPLC 色譜儀測定其液相圖譜，利用《中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）》軟件，導入色譜數據，并通過比較圖譜相似度來分析實驗結果。見圖1。

圖1 15批三棱標準湯劑特征圖譜共有峰

2.2.8共有峰的確認使用中位數計算方法，對圖譜進行多點校正，自動匹配色譜峰，生成對照指紋圖譜，其中共有峰有8 個。峰1 為香草酸，峰2 為香草醛，峰3 為對香豆酸；峰5 為阿魏酸。參照峰設定為對香豆酸，算出8 個共有峰的相對保留時間，結果分別為0.57、0.86、1.00、1.16、1.25、2.29、2.61、2.75。見圖2。

圖2 三棱標準湯劑對照特征圖

2.2.9相似度評價經過相似度評價系統評測后，算出相似度，結果顯示均高于0.98，見表2，說明15批三棱標準湯劑樣品比較一致。

表2 15批三棱標準湯劑指紋圖譜相似度

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1色譜條件同“2.2.1”項下。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取對香豆酸對照品17.49 mg 置100 mL 棕色量瓶中，加乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密移取10 mL 置100 mL棕色量瓶中，加乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為17.48 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.3供試品溶液的制備同“2.2.3”項下。

2.3.4專屬性試驗取空白溶液、對香豆酸對照品溶液、三棱標準湯劑供試品溶液，分別進樣檢測，結果顯示空白溶液對檢測無干擾，色譜峰分離度大于1.5，且供試品與對照品色譜峰保留時間一致，說明專屬性良好。見圖3。

圖3 專屬性試驗色譜圖：A.空白溶液；B.對香豆酸對照品溶液；C.三棱標準湯劑供試品溶液

2.3.5精密度試驗連續進樣同一個對照品溶液6次，結果RSD 值小于0.8%，表明儀器具備良好的精密度。

2.3.6重復性試驗按“2.2.3”項下的操作方法，同時制備六份供試品溶液，進樣測定并計算對香豆酸含量及RSD 值。結果顯示其含量均值為0.021 7%，RSD 值為0.7%，表明實驗具有較好的重復性。

2.3.7穩定性試驗取同一份三棱標準湯劑供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、24 h 進樣，檢測結果顯示對香豆酸峰面積RSD 值為0.7%，表明三棱標準湯劑供試品在24 h 內基本穩定。

2.3.8線性試驗取17.48 μg/mL 對香豆酸對照品溶液,分別稀釋成濃度為0.874、1.748、3.496、4.370、6.992、8.740 μg/mL 的對照品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件檢測其在不同濃度下的峰面積，然后將對香豆酸濃度（X）設置為橫坐標，其色譜峰面積（Y）設置為縱坐標，通過線性回歸分析得到其回歸方程為Y=0.432 6X-0.044 7（r=0.999 9），表明在0.874～17.480 μg/mL 范圍里，對香豆酸濃度與峰面積線性關系良好。

2.3.9加樣回收試驗取已知含量三棱標準湯劑樣品6 份，按100%加入量分別加入適量的對香豆酸對照品，按“2.2.3”項下操作方法制備，計算回收率，結果顯示標準湯劑中對香豆酸平均回收率為94.47%，RSD 值為1.0%，說明該方法準確性良好。見表3。

表3 加樣回收試驗結果

2.3.10不同批次標準湯劑含量測定結果依照“2.2.3”項的操作步驟，對15 批三棱標準湯劑供試品溶液進行制備，檢測其對香豆酸含量，所得數據結果見表4。

表4 15批三棱標準湯劑對香豆酸含量 %

3 討論

分別在254、300、360 nm 下對三棱標準湯劑進行檢測。在254 nm 時圖譜中脂溶性成分色譜峰響應值低，色譜峰數量較少；在360 nm 時圖譜中水溶性成分色譜峰響應值低，色譜峰數量較少；將波長設置為300 nm 時，相應的水溶性色譜峰以及脂溶性色譜峰都出現了比較高的響應值，各峰分離狀態情況好，基線比較穩定，所以將波長參數設置為300 nm。因為柱溫會影響色譜峰的保留時間，故分別對比各色譜峰在柱溫為30、35、40 ℃時的分離度，發現當柱溫為35 ℃時，各峰分離效果較好。

對三棱標準湯劑的提取方式、提取溶劑及提取時間進行考察，通過比較峰面積大小來確定三棱標準湯劑特征圖譜的樣品前處理方法。提取所使用的方式主要對比了超聲以及回流提取，提取溶劑對比70%甲醇、70%乙醇以及水三種溶劑，提取時間比較了15、30、45 min。結果發現，在相同時間下超聲和回流對于指紋圖譜和對香豆酸含量結果影響不大。提取溶劑對比試驗中，70%甲醇、70%乙醇提取的情況比較好，考慮到乙醇毒性較低，所以本研究使用了70%乙醇。超聲時間對比試驗結果說明超聲提取30 min，各成分的提取程度已經達到了峰值。

UPLC 指紋圖譜有助于對配方顆粒、標準湯劑等中藥制劑進行質量控制。通過計算，對照指紋圖譜和15 批三棱標準湯劑的UPLC 指紋圖譜相似度范圍在0.985～0.998 之間，可見不同產地來源和批次的三棱飲片制備所得的三棱標準湯劑具有良好的一致性，但對香豆酸含量RSD 值為25.3%，差異較大，說明三棱標準湯劑的含量受三棱飲片產地來源影響較明顯。