不同產地覆盆子藥材的指紋圖譜研究

劉桂鳳，丁銀平，周志強，鄭盈瑩，任琦

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 干燥果實，主要分布在江西、福建、浙江等地，用于陽痿早泄、目暗昏花等病癥［1］。覆盆子的質量評價目前主要側重于鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等活性成分的含量測定研究［2-6］，難以評價其整體質量。中藥指紋圖譜可宏觀反映中藥化學信息，具有整體性強、穩定性好等特點［7-8］，是當今公認的中藥質量控制模式，在評價中藥真偽優劣和確保藥材一致穩定方面具有顯著優勢。關于覆盆子指紋圖譜的研究目前已有少數報道［9-11］，但未見對不同產地藥材粉末的研究。由于覆盆子分布區域較廣，各產地質量不一，因此采用指紋圖譜評價不同產地覆盆子質量很有必要。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法，以6 號峰（鞣花酸）為參照，建立不同產地覆盆子的指紋圖譜，為其質量控制與資源開發提供一定參考。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；KQ-500DE 數控型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器公司）；數顯恒溫水浴鍋［國華（常州）電器公司］；梅特勒ML204 型電子天平（梅特勒托利多公司）；Secura 126-1CN 型電子天平（德國賽多利斯公司）。椴樹苷對照品（批號112000-201501，含量以100%計），山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品（批號121007-201602，含量以90.8%計），鞣花酸對照品（批號111959-201903，含量以88.3%計），蘆丁對照品（批號100080-201811，含量以91.6%計），槲皮素對照品（批號100081-201610，含量以99.1%計），山柰素（山柰酚）對照品（批號110861-201812，含量以93.8%計），以上對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。色譜甲醇和色譜乙腈（sigma 公司）、色譜磷酸（上海麥克林試劑公司）、水為Milli-Q 制備的超純水。覆盆子藥材于2022 年5 月收集于樟樹藥材市場及藥農手中，經江西省藥品檢驗檢測研究院中藥室主管中藥師丁銀平鑒定為華東覆盆子Rubus chingiiHu，具體樣品信息見表1。

表1 覆盆子樣品信息

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1混合對照溶液的制備分別精密稱取山柰酚-3-O-蕓香糖苷、椴樹苷、鞣花酸、蘆丁、槲皮素、山柰素對照品適量，加甲醇使溶解制成每1 mL 含山柰酚-3-O-蕓香糖苷10 μg、椴樹苷10 μg、鞣花酸20 μg、蘆丁10 μg、槲皮素10 μg、山柰素10 μg 的混合對照溶液。

2.1.2供試品溶液的制備精密稱取覆盆子粉末（過二號篩）約0.5 g，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，85% A；8～23 min，85%→67% A；23～39 min，67%→58% A；39～45 min，58%→72%A）；檢測波長為360 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣體積為10 μL。

2.3 精密度試驗

取覆盆子藥材（批號：YL220530059）粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件重復進樣6 次，以鞣花酸峰為參照，記錄色譜圖。結果13 個共有峰相對保留時間RSD 均小于0.1%,相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗

取覆盆子藥材（批號：YL220530059）粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0 h、3 h、7 h、11 h、16 h、24 h，照“2.2”項下色譜條件進樣，以鞣花酸峰為參照，記錄色譜圖。結果13 個共有峰相對保留時間RSD 均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內基本穩定。

2.5 重復性試驗

取覆盆子藥材（批號：YL220530059）粉末6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.2”項下色譜條件進樣，以鞣花酸峰為參照，記錄色譜圖。結果各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明本方法重復性較好。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

取9 批覆盆子藥材照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制樣，按“2.2”項下條件進樣，得到覆盆子指紋圖譜，如圖1所示。將覆盆子指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，生成對照圖譜，如圖2。覆盆子指紋圖譜共標定13 個共有色譜峰。13 個共有峰的相對保留時間與相對峰面積見表2、表3。

圖1 9 批覆盆子疊加指紋圖譜

圖2 覆盆子對照指紋圖譜

表2 覆盆子藥材共有峰的相對保留時間 min

表3 覆盆子藥材共有峰的相對峰面積

2.6.1峰的確認經與對照品溶液的保留時間和紫外吸收光譜圖對比，指認出6 個成分，分別是蘆?。? 號峰）、鞣花酸（6 號峰）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（8 號峰）、椴樹苷（11 號峰）、槲皮素（12號峰）、山柰素（13 號峰）。混合對照品圖譜見圖3。

圖3 混合對照品圖譜

2.6.2不同產地覆盆子相似度結果計算9 批覆盆子樣品與對照圖譜的相似度，結果見表4。9 批樣品相似度計算結果在0.933～0.992，不同產地覆盆子藥材化學成分基本一致。

表4 相似度評價結果

2.6.3不同產地覆盆子聚類分析結果采用SPSS13.0統計學軟件對9 批覆盆子藥材相對峰面積進行聚類分析（between-groups linkage，平方euclidian 距離），結果見圖4。根據樹狀圖結果可知9 批樣品大體聚為2 類，1、2、3 為一類；4、5、6、7、8、9 為一類。結合樣品產地看，前者樣品來源于浙江，后者樣品采自于江西，與聚類分析結果相一致。表明樣品化學成分的相對含量受產地影響。

圖4 聚類分析結果

3 討論

本研究考察了254 nm、316 nm、344 nm、360 nm四個檢測波長，經比較發現在360 nm 處樣品色譜信息豐富，基線穩定，各色譜峰分離度較好且具有較好的紫外吸收，故檢測波長定為360 nm。同時考察了Intersil ODS-SP（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱和依利特C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱，在同一色譜條件下使用三種色譜柱對同一樣品進行分析，結果色譜峰峰形良好，表明不同品牌色譜柱對色譜峰影響不大。

覆盆子主要的活性成分為黃酮類化合物。本研究采用甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇作提取溶劑。以甲醇和70%甲醇提取的色譜峰峰面積較大，考慮到節能環保，選擇70%甲醇作提取溶劑。同時比較超聲1 h 和回流1 h，發現加熱回流的樣品色譜信號峰較多，故本實驗采用加熱回流1 h 的提取方法。

本研究采用HPLC 法建立了不同產地覆盆子藥材的指紋圖譜，該方法具有良好的穩定性和重現性；9 批覆盆子指紋圖譜相似度均大于0.9，表明不同產地的覆盆子活性成分具有相似性，整體質量一致；但每個共有色譜峰的相對峰面積受產地環境影響而相對含量不同。樣品化學成分的相對含量不僅受產地影響，還與樣品采集時間、加工方式、儲存條件及儲存時間有關［12-13］。本研究建立的指紋圖譜方法穩定，可為覆盆子藥材的資源開發與質量控制提供參考。