刺槐素激活PPARγ/NF-κB 通路改善高糖/高脂應激所致血管內皮細胞功能失調的研究

甘璐，孫曉春，彭國平，張潔，熊紹風，饒毅

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006；3.江西應用科技學院，江西南昌 330100

糖尿病是當今世界三大疾病之一，其發病率及死亡率逐年上升，已成為各國關注的公眾健康難題［1］。眾所周知，糖尿病是一種體內呈現以高血糖為特征的蛋白質、糖、脂肪代謝等紊亂的綜合性疾病，也是一種常見的慢性病［2］。正常的血管內皮細胞能夠產生許多有益的細胞因子，達到維持血管的正常舒縮、抗血栓、抑制脂質聚積，抗炎等功能。當血管內過多的葡萄糖和脂質長期刺激內皮細胞時，會造成內皮細胞功能失常，這種失常也為糖尿病血管并發癥的發生提供了始動因素［3］。

黃酮類化合物是有諸多藥理作用的一類物質，通常具有抗腫瘤，抗炎，抗氧化，抗病毒等多種藥理活性［4-7］。刺槐素（acacetin,ACA,5,7-二羥基-4'-甲氧基黃酮）是天然的黃酮類化合物，廣泛存在于多種傳統藥用植物中，具有多種藥理活性［8-12］。深入研究血管內皮細胞功能失調產生的相關病理機制或相關作用分子及藥物是治療代謝綜合征的重要方向，也是提高患者的生活質量的重要方法，同時，糖尿病患者心腦血管并發癥的發病率也會大大降低［13］。本研究從ACA 對高糖/高脂（HG/HF）應激下人體臍靜脈內皮細胞（HUVECs）功能失常的保護作用及其相關機制出發，探究ACA 對HG/HF 應激HUVECs功能失常的保護作用。確認ACA 對HG/HF 應激誘導內皮功能失常的保護作用是否與PPARγ/NF-κB通路有關，為臨床上治療HG/HF 應激下的血管內皮細胞失常及周圍血管病提供重要的實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株、培養基及血清

實驗用人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）株購自美國ATCC（Catalog No: CRL1730）；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司。

1.2 試劑盒及試劑

人內皮素-1（ET-1）酶聯免疫檢測試劑盒（EK-M28801）、NO 檢測試劑盒（R-1045）與凋亡試劑盒（G003-1-3）均購自南京建成科技有限公司；qRT-PCR 逆轉錄試劑盒（#22106-01）購自Tolobio公司；其他未詳列試劑均購自北京Solarbio 公司。

1.3 主要儀器

680 型酶標儀（BIO-RAD，美國）；逆轉錄儀（BIO-RAD，美國）；PCR 儀（BIO-RAD，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）。

2 方法

2.1 HUVECs 細胞培養

細胞培養參照熊紹風［14］的細胞方法進行，用1%內皮細胞生長因子（ECGS）和10%FBS 含雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM 作為細胞培養基，細胞放置于37 ℃，含5% CO2的恒溫孵育箱中培養。

2.2 劃痕實驗檢測細胞愈合修復水平

HUVECs 以每孔2×105個接種于6 孔板中孵育，待細胞長至融合度為90%時，用200 μL 槍頭沿著直線劃細胞，然后棄去培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗三遍；后加入完全培養基；繼續放入孵箱24 h，其中在0 h，24 h 時間點取出置于倒置顯微鏡下觀察細胞愈合距離的變化并做好記錄。

2.3 流式細胞儀測定HUVECs 細胞凋亡水平

根據試劑盒說明書要求，按步驟依次加入各種試劑，最后采用流式細胞儀測定。

2.4 硝酸還原酶法測定NO 含量

取細胞上清液至EP 管中，分為空白管、標準管和測定管。按照NO 試劑盒說明書配好試劑并加入到EP 管中混勻，37 ℃水浴60 min，最后取上清液進行后續操作；加入顯色劑后混勻，室溫靜置10 min，用酶標儀在550 nm 下測定吸光度值。

2.5 qRT-PCR 檢測PPARγ/NF-κB 通路mRNA

用胰島素（100 nmol/L）處理30 min，去除細胞上清液，采用Trizol 法提取各組細胞RNA，用qRT-PCR逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，PCR 擴增體系為20 μL，其中cDNA 為2 μL，上下游引物各0.8 μL，PCR 循環數為39，95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸32 s［15］，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 ELISA 法檢測細胞上清液ET-1 水平

按說明書步驟用標準溶液建立標準曲線，樣品準備，封閉，上一抗二抗，加顯色劑顯色，最后用酶標儀測定吸光度，代入標準曲線中計算樣品的ET-1 含量。

2.7 實驗分組

2.7.1不同濃度ACA 對HUVECs 細胞活力的影響將HUVECs 細胞均勻接種于培養皿，隨機分為七組，即Ctrl 組（加入正常培養基），ACA（濃度為5、10、20、40、80、160 μmol/L）組。

2.7.2ACA 對HG/HF應激下HUVECs細胞損傷的影響將HUVECs 細胞均勻接種于培養皿，隨機分為四組，即Ctrl、HG/HF（44/1.0 mmol/L）、ACA（40 μmol/L）、HG/HF+ACA（40 μmol/L）組。

2.7.3PPARγ/NF-κB 通路抑制劑逆轉ACA 對HG/HF應激下HUVECs 細胞損傷的修復作用將HUVECs細胞均勻接種于培養皿，隨機分為五組，即Ctrl、HG/HF（44/1.0 mmol/L）、ACA（40 μmol/L）、HG/HF+ACA（40 μmol/L）、HG/HF+ACA（40 μmol/L）+T0070907（10 μmol/L）組。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 不同濃度ACA 對 HUVECs 細胞活力的影響

圖1 結果顯示：當ACA 濃度大于或等于80 μmol/L時，細胞活力顯著下降（P<0.01），呈現出明顯的細胞毒性，因此確認藥物安全濃度范圍為小于或等于40 μmol/L，同時選擇40 μmol/L 作為實驗最適濃度。

圖1 不同濃度ACA對 HUVECs 細胞活力的影響

3.2 ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞損傷的影響

根據分組要求處理細胞24 h 后，檢測ACA 對HUVECs 細胞損傷的影響，同時檢測ACA 對HUVECs細胞PPARγ/NF-κB 通路的影響。

3.2.1ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞愈合率的影響如圖2 所示，HG/HF 組的細胞愈合率相比于Ctrl 組顯著下降（P<0.01），然而加入HG/HF+ACA的實驗組細胞愈合率比HG/HF 組明顯提高，與正常組的愈合率接近。

圖2 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞愈合率的影響：A.細胞劃痕圖；B.細胞遷移率

3.2.2ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞凋亡率的影響如圖3 所示，HG/HF 組的細胞凋亡率相比于Ctrl 組顯著升高（P<0.01），然而加入HG/HF+ACA的實驗組細胞凋亡率比HG/HF 組明顯降低，與正常組的凋亡率接近。

圖3 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞凋亡率的影響：A.細胞凋亡圖；B.細胞凋亡率

3.2.3ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞ET-1、NO含量的影響如圖4 所示，ACA 可以逆轉由HG/HF應激介導的ET-1 含量的增加和NO 含量的減少。

圖4 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞ET-1、NO的影響：A.ET-1含量；B.NO含量

3.2.4ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞PPARγ/NF-κB 通路mRNA 的影響如圖5 所示，HG/HF應激能顯著降低PPARγ 和NF-κB 的mRNA 表達，而在ACA 的加入下，PPARγ 和NF-κB 的mRNA表達顯著增加。

圖5 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞PPARγ/NF-κB通路mRNA的影響

3.3 T0070907 逆轉ACA 對HG/HF 應激下HUVECs細胞損傷的修復作用

根據分組要求，處理細胞24 h 后，檢測PPARγ/NF-κB通路抑制劑參與下ACA對HG/HF應急下HUVECs 細胞損傷的影響。

3.3.1對PPARγ/NF-κB 通路mRNA 的影響如圖6所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制PPARγ 和NF-κB 的mRNA 的表達。

3.3.2對HG/HF 應激下HUVECs 細胞愈合修復作用如圖7 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞愈合的修復作用。

圖7 對HG/HF應激下HUVECs細胞愈合修復作用：A.細胞劃痕圖；B.細胞遷移率

3.3.3對HG/HF 應激下HUVECs 細胞凋亡的修復作用如圖8 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞凋亡的修復作用。

圖8 對HG/HF應激下HUVECs細胞凋亡的修復作用：A.細胞凋亡圖；B.細胞凋亡率

3.3.4對HG/HF 應激下HUVECs 細胞ET-1、NO 含量的影響如圖9 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制ACA 對HG/HF 應激下HUVECs細胞ET-1 含量的減少和NO 含量的增加。

圖9 對HG/HF應激下HUVECs細胞ET-1、NO的影響：A.ET-1含量；B.NO含量

4 討論

高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病與血管功能障礙密切相關，并加速著血管功能障礙的進展，同時血管功能障礙也增加心腦血管疾病患病幾率［16］。血糖慢性增高則是糖尿病最顯著的特征，且隨著病情的進展，會導致一系列并發癥（如視網膜病變、周圍神經病變、糖尿病腎病、糖尿病足及周圍血管病變等）的發生，給患者的日常生活及身心健康帶來了嚴重的影響［17-19］。高血脂是導致糖耐量發生異常的一個危險促進因素。長期高血糖合并高血脂，將給機體的正常代謝帶來嚴重損害，使得患者并發癥的發生率顯著升高［20］。已有研究證實HG/HF 可以誘導HUVECs 細胞功能失常［21］，因此，明確HUVECs 細胞功能失常的作用機制對防治包括糖尿病血管并發癥和動脈粥樣硬化等疾病有重要意義。

有研究證實，ACA 可以通過抑制細胞內氧化應激和ERS 來保護RINm5F 胰島β 細胞免受脂毒性介導的胰島損傷，且ACA 對胰島細胞的保護作用可能與CHOP 介導的凋亡途徑密切相關［22］。網絡藥理學和分子對接技術預測了ACA 作用的潛在靶點為TNF-α，信號通路為IKKα/β-NF-κB，并闡明了ACA 可通過抑制HG 誘導的NF-κB 入核和轉錄活性的異常升高，降低TNF-α 水平以此改善HG 誘導IR［23］。

本研究從NO 含量、ET-1 含量、細胞愈合率和細胞凋亡率四個方面探究ACA 對HG/HF 應激造成的HUVECs 細胞功能失常的修復作用，并且發現其修復作用機制可能是通過激活PPARγ/NF-κB 通路實現的，為研究高糖高脂引起的內皮細胞功能失常提供了新靶點，同時，為臨床上治療動脈粥樣硬化等血管內皮失調性疾病提供了理論依據。但由于實驗條件的局限性，本研究僅在細胞水平證明了ACA的作用，接下來我們將從動物實驗方面進行進一步驗證。