減肥膠囊顯微鑒別及含量測定方法研究

賈力，王蕾，支榮榮

鹽城市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 鹽城 224055

減肥膠囊現行質量標準為國家藥品監督管理局標準WS-11266（ZD-1266）-2002，由番瀉葉、虎杖、海藻酸鈉、人參莖葉皂苷粉組成。該制劑具有清熱、活血、降濁的功效，用于痰瘀互結之高脂血癥［1］。處方中番瀉葉具有瀉熱行滯，通便，利水的功效。番瀉葉中含有二蒽酮類衍生物，具有瀉下的作用，其中瀉下作用最為顯著的是番瀉苷A 和番瀉苷B［2-3］。虎杖具有利濕退黃，清熱解毒，散瘀止血的功效?，F代藥理研究表明，虎杖及其活性成分虎杖苷具有降血脂、改善微循環、抗氧化等作用［4-5］。

現行標準由于批準日期較早，限于當時的技術研究條件，檢驗項目僅有理化鑒別、HPLC 測定大黃素含量。而大黃素具有抗炎的作用，并沒有瀉下清熱及降血脂的功效，顯然作為質控指標是不合理的。因此，本研究以番瀉葉中番瀉苷A 和番瀉苷B，虎杖中虎杖苷三個有效成分為對象，建立HPLC 法同時測定三種成分的含量，以期更為簡便、全面地控制該制劑質量。另外，番瀉葉、虎杖在處方中均以中藥原粉入藥，未經提取工藝，本研究建立了該兩種中藥粉末的顯微鑒別方法。

處方中海藻酸鈉是藻類植物的提取物，但其含量測定方法目前尚無報道；人參莖葉皂苷具有活血化瘀功效，對高血脂具有輔助治療的功效，質量標準中已建立TLC 鑒別方法，故本研究未對海藻酸鈉及人參莖葉皂苷含量測定作進一步研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LEICA DM 3000 顯微鏡（德國萊卡顯微系統有限公司）；Ultimate U3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；BP211D 電子天平（梅特勒托利多科技有限公司）；Milli-Q 超純水系統（德國默克科技有限公司）。

1.2 試劑試藥

番瀉苷A 對照品（批號：110824-202003，含量：97.2%），番瀉苷B 對照品（批號：110825-202004，含量：96.0%），虎杖苷對照品（批號：111575-201603，含量：87.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；醋酸、磷酸氫二鈉、醋酸鈉、碳酸氫鈉、四庚基溴化銨、乙腈、乙醇等均為色譜純，水合氯醛、丙三醇為分析純；減肥膠囊（吉林省銀諾克藥業有限公司,國藥準字Z20026991，批號：20210801、20210703、20200506，規格：0.3 g/粒）。

2 實驗方法與結果

2.1 顯微鑒別［6-7］

番瀉葉粉末顯微特征：晶纖維多。非腺毛單細胞，長100～350 μm，直徑12～25 μm，壁厚，有疣狀突起。草酸鈣簇晶存在于葉肉薄壁細胞中，直徑9～20 μm。上下表皮細胞表面觀呈多角形，垂周壁平直；上下表皮均有氣孔，主為平軸式，副衛細胞大多為2～3 個。見圖1。

圖1 番瀉葉粉末顯微圖（×400倍）

虎杖粉末顯微特征：草酸鈣簇晶極多，較大，直徑30～100 μm。石細胞淡黃色，類方形或類圓形，有的呈分枝狀，分枝狀石細胞常2～3 個相連，直徑24～74 μm，有紋孔，胞腔內充滿淀粉粒。木栓細胞多角形或不規則形，胞腔充滿紅棕色物。具緣紋孔導管直徑56～150 μm。見圖2。

圖2 虎杖粉末顯微圖（×400倍）

2.2 番瀉葉、虎杖主成分的含量測定

2.2.1色譜條件［8］色譜柱：SVEA opal C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-［醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.0）（1 →10）混合溶液1 000 mL 中，加入四庚基溴化銨2.45 g］（23∶77）；檢測波長：260 nm（番瀉苷A、番瀉苷B），306 nm（虎杖苷）；柱溫：30 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備分別取番瀉苷A 對照品10.52 mg、番瀉苷B 對照品15.79 mg、虎杖苷對照品11.58 mg，分別置25 mL、50 mL、100 mL 棕色量瓶中，分別加0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液制成每1 mL 含番瀉苷A 0.409 0 mg、番瀉苷B 0.303 2 mg、虎杖苷0.101 1 mg 的對照品儲備溶液（供加樣回收率試驗用）。分別精密吸取三種儲備液1 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液至刻度，制成每1 mL 含番瀉苷A 40.90 μg、番瀉苷B 30.32 μg、虎杖苷10.11 μg 的對照品混合溶液（供含量測定及線性關系考察用）。

2.2.3供試品溶液的制備取樣品細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理15 min（30～40 ℃），放冷，再稱定重量，用0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4陰性對照溶液按照質量標準制備工藝制備取缺番瀉葉及缺虎杖的陰性樣品，各取0.5 g，同供試品溶液的制備方法制備。

2.2.5專屬性試驗精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.2.1”項下方法測定。結果供試品色譜在與混合對照品色譜相應的位置上有相同色譜峰，番瀉葉陰性樣品在番瀉苷A 和番瀉苷B 的位置上無色譜峰，虎杖陰性樣品在虎杖苷的位置上無色譜峰。表明供試品中其他成分對目標成分無干擾，本方法有良好的專屬性。見圖3。

圖3 專屬性試驗色譜圖:A.番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺番瀉葉陰性對照溶液；D.缺虎杖陰性對照溶液

2.2.6線性關系考察精密量取“2.2.2”項下對照品溶液1、2、4、10、16、20、30 μL 進行測定，以峰面積Y為縱坐標，對照品的質量X（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程，結果表明，各成分在各自范圍內與峰面積呈良好的線性關系。見表1。

表1 線性關系表

2.2.7精密度試驗精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液，連續進樣6 次，番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷峰面積的RSD 分別為0.20%、0.52%、0.78%（n=6），精密度良好。

2.2.8穩定性考察吸取同一份供試品溶液，于0，6，12，24，48 h 分別進樣10 μL，按“2.2.1”項下條件測定，番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷峰面積的RSD 分別為0.30%、0.63%、0.55%（n=5），供試品溶液在48 h 內穩定。

2.2.9重復性試驗精密稱取同一批樣品（批號為20210801），按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法平行制備6 份，依次測定，番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷的平均含量分別為1.486 2 mg/g、1.066 5 mg/g、0.433 3 mg/g，RSD 分別為0.41%、0.55%、0.98%，重復性良好。

2.2.10加樣回收率試驗精密稱取已知含量的樣品0.25 g，六份，分別精密吸取“2.2.2”項下的番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷對照品儲備溶液各0.9 mL（0.368 1 mg）、0.9 mL（0.272 9 mg）、1.0 mL（0.101 1 mg），依法制得供試品溶液（對照品體積代入公式計算含量）。分別吸取上述溶液各10 μL 測定回收率。見表2～4。

表2 番瀉苷A加樣回收率試驗結果（n=6）

表3 番瀉苷B加樣回收率試驗結果（n=6）

表4 虎杖苷加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2.11樣品含量測定照“2.2.1”項下方法測定3批樣品，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果 mg/g

3 討論

3.1 顯微特征的選擇

處方中，海藻酸鈉和人參莖葉皂苷粉均為提取物，不具備生藥組織細胞特征，番瀉葉和虎杖均為原粉入藥，番瀉葉具有晶纖維、非腺毛、草酸鈣簇晶、表皮細胞（氣孔）等特征，虎杖具有草酸鈣簇晶、石細胞、木栓細胞、具緣紋孔導管等特征。兩味藥組織特征差異較大，具有較強的專屬性，雖然兩者均有草酸鈣簇晶，但是番瀉葉簇晶細小，而虎杖簇晶粗大，很易區分，因此，直觀、簡便、環保的顯微鑒別可以代替薄層色譜等其他鑒別方法。

3.2 色譜條件的選擇

選擇比較了《中國藥典》2020 年版一部番瀉葉和虎杖含量測定項中的流動相［8］，番瀉苷A、番瀉苷B 在虎杖含量測定流動相系統中，不能出峰，而虎杖苷在番瀉葉含量測定所用流動相中能有效分離，且準確度、精密度均符合藥典要求，故選擇番瀉葉含量測定的流動相系統。同時比較了乙腈-0.1%三氟乙酸、乙腈-0.1%磷酸流動相，供試品分離度均較差［9-10］。

3.3 供試品提取方法的選擇

番瀉苷在0.1%碳酸氫鈉溶液中溶解性較好，虎杖苷在稀乙醇中溶解度較好［8］，兼顧兩種成分的溶解性，本研究采用0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液同時提取兩種成分，經與《中國藥典》規定的兩種藥材提取溶劑比較，提取效率相當。本研究還考察了溶劑體積、回流、超聲、提取時間等因素，最終確定了“2.2.3”項下供試品制備方法?？紤]到虎杖苷對光的不穩定性，實驗需要避光。