夏枯草提取物含藥血清的體外抗炎活性研究

鄭洋濱，劉寧，周年，熊明朋，洪燕

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

夏枯草為唇形科夏枯草屬植物，味辛、苦，寒，歸肝、膽經，具有清火瀉火、明目、散結消腫之功效；主要具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓等藥理作用［1］。夏枯草口服液和夏枯草膏已廣泛應用于臨床，主要有清火，散結，消腫的作用。已有文獻報道夏枯草提取物在體外有一定的抗炎作用［2-5］，但由于中藥提取物成分復雜，在體內經過一系列代謝后難以保證達到和體外一樣的藥效。將中藥提取物對動物進行灌胃后，取動物的含藥血清用于體外實驗，就比較接近于藥物在人體內環境產生的藥理作用［6］。因此，本研究通過細菌脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬細胞RAW 264.7 造成炎癥模型，觀察夏枯草提取物含藥血清對炎性因子一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠40只，180～220g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物合格證號：NO.430726211100071368，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014。飼養于江西省藥品檢驗檢測研究院屏障級環境中，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2019-0001。

1.2 細胞株

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW 264.7）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 實驗樣品及試劑

夏枯草藥材購自黃慶仁棧華氏大藥房，經國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室萬林春主任中藥師鑒定為正品。RAW 264.7 專用完全培養基、無血清的DMEM 培養基、脂多糖（LPS）（批號分別為WH1622C291、WH0021D161、No.0109A031，均購自上海語純生物科技有限公司）。一氧化氮含量檢測試劑盒［批號：No.20220406，金克隆（北京）生物技術有限公司，批號：No.20220406］。小鼠IL-1β ELISA 試劑盒、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（批號均為04/2022，均購自上海語純生物科技有限公司）。

1.4 實驗儀器

CO2恒溫培養箱（賽默飛世爾科技公司，型號：311）；酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號MULTISKAN GO）；細胞計數器（上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備

SD 大鼠40 只，適應性喂養5 d 后，隨機分為空白對照組和夏枯草氯仿提取物組，夏枯草乙酸乙酯提取物組，夏枯草正丁醇提取物組，每組10 只。灌胃給予相應的藥物溶液（按照得率計算12.5 mg/kg），10 mL/kg，每天2 次，連續3 d，空白對照組給予等體積的純化水。末次給藥后1 h，麻醉大鼠，經腹主動脈取血，4 ℃靜置30 min 后，3 000 r/min 離心15 min 分離含藥血清。將同組大鼠血清混勻，56 ℃水浴加熱30 min 滅活血清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-20 ℃保存備用。

2.2 含藥血清對細胞增殖度的影響試驗

取生長狀態良好的RAW 264.7 細胞，取用無菌細胞刮刮下細胞，再用槍吹打成單細胞懸液。將細胞懸液離心（1 000 r/min，5 min），棄去上清，用無血清的DMEM 培養基調細胞數為1×105個/mL，100 μL/孔接種于96孔板。待細胞貼壁后吸去培養基，按空白對照（10%胎牛血清），陰性對照（20%空白對照組大鼠血清），5%、10%、20%各提取物組含藥血清孵育，每組設6 個復孔，每孔加100 μL。孵育24 h 后，吸棄上清，每孔加100 μL 不含血清的DMEM 培養基和20 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT，繼續培養4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL 的DMSO，490 nm 處測定吸光度。細胞增殖率=各給藥組吸光度/空白對照組吸光度×100%。

2.3 含藥血清對巨噬細胞RAW264.7 的炎性因子的影響試驗

取生長狀態良好的RAW 264.7 細胞，用細胞刮刮下細胞，吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液離心（1 000 r/min，5 min），棄去上清，用無血清的DMEM 培養基調細胞數為1×105個/mL，接種于24 孔板中，每孔1.5 mL，24 h 細胞貼壁后，加入相應血清。

LPS 用無血清 DMEM 培養基溶解，稀釋至濃度100 μg/mL 作為母液。將貼壁后細胞分為陰性對照組，模型對照組，各提取物高、中、低劑量組（分別為20%含藥血清、10%含藥血清、5%含藥血清）。陰性對照組加入空白對照組大鼠血清400 μL 和無血清DMEM 培養基100 μL；模型對照組加入空白對照組大鼠血清400 μL、無血清DMEM 培養基80 μL 和LPS 母液20 μL；20%含藥血清組加入含藥血清400 μL、無血清DMEM 培養基80 μL 和LPS 母液20 μL；10%含藥血清組加入含藥血清200 μL、空白對照組大鼠血清200 μL、無血清DMEM 培養基80 μL 和LPS 母液20 μL；5%含藥血清組加入含藥血清100 μL、空白對照組大鼠血清300 μL、無血清DMEM 培養基80 μL 和LPS 母液20 μL。

每一劑量組設3 個復孔，LPS 終濃度為1 μg/mL。繼續孵育24 h 后，收集上清液，采用ELISA 法按照試劑盒說明書測定的含量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 含藥血清對細胞增殖度的影響

試驗結果表明，夏枯草各提取物含藥血清對RAW 264.7 的增殖無影響。見圖1。

圖1 含夏枯草各提取物血清對細胞增殖度的影響

4.2 含藥血清對巨噬細胞RAW264.7 的炎性因子的影響

試驗結果表明，模型對照組各炎性因子含量均顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義。高、中、低劑量的夏枯草氯仿提取物含藥血清均能降低IL-6和NO 含量，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；此外，高、中劑量的夏枯草氯仿提取物含藥血清還能降低IL-1β 和TNF-α 含量，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 含藥血清對巨噬細胞RAW264.7的炎性因子的影響（，n=3）

注：與陰性對照組比較，aP<0.01；與模型對照組比較，bP<0.01，cP<0.05。IL-1β：白細胞介素1β；IL-6：白細胞介素6；NO：一氧化氮；TNF-α：腫瘤壞死因子。

5 結論

內毒素誘導的RAW264.7 細胞模型，被廣泛用于體外的抗炎實驗中。RAW264.7 細胞在LPS 刺激下，可使細胞炎癥介質和促炎細胞因子的分泌增加，如：TNF-α、IL-6 和IL-1β、NO。IL-1β 是最重要的炎性細胞因子之一，它介導了炎癥的重要過程，大量產生時引起發熱和惡病質［6］。TNF-α 是炎癥反應的始動因子，可使黏附的中性粒細胞產生呼吸爆發，并促進其他多種促炎細胞因子的表達［7-9］。IL-6 多功能炎性細胞因子，具有致炎和抗炎的雙向功能，當產生過多會引起一系列的炎性損害，體內IL-6 水平上升，可以導致多種疾病［10-11］。NO 在炎癥反應中的作用機制復雜，不同酶產生的NO 作用不一，在病理狀態中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）廣泛表達，NO 水平升高造成局部組織損傷［12-13］。

本次試驗中，經20%、10%和5%氯仿提取物含藥血清孵育后，可顯著降低LPS 誘導的RAW264.7細胞分泌的IL-6 和NO 水平（P<0.05）。經20%和10%氯仿提取物含藥血清孵育后，可顯著降低LPS誘導的RAW264.7 細胞分泌的IL-1β 和TNF-α 水平（P<0.05）。正丁醇和乙酸乙酯提取物含藥血清對炎性因子均無顯著影響，說明無抗炎作用。

綜上所述，夏枯草氯仿提取物含藥血清能顯著降低炎癥模型中的炎性因子含量。但是其具體的作用機制，還有待進一步試驗。