血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯合檢測對早期鼻咽癌的診斷價值

陳 琦 崔哲卿 黃維平

鼻咽癌是起源于鼻咽部上皮的惡性腫瘤[1-3]。目前,采用常規檢查方法如電子鼻咽鏡檢查、計算機斷層掃描及磁共振成像早期發現,結合病理確診后立即采取有效的治療策略,近年來鼻咽癌死亡率逐漸下降,但是仍有一部分鼻咽癌患者直到疾病的晚期才被診斷出來,其對常規治療的敏感性仍然較差[4]。鼻咽癌在早期無癥狀疾病狀態時,由于其隱匿性,不易被發現[5]。因此,為改善鼻咽癌患者的臨床預后,需要提出新穎、可靠的篩查方案。microRNA(miRNA)是一種長度約為22個核苷酸的小型非編碼RNA,其功能為基因表達的轉錄后調節因子,在多種腫瘤中表達失調,包括鼻咽癌[6]。已經為包括鼻咽癌在內的多種癌癥類型定義了預后和預測miRNA生物標志物,這些生物標志物為評估疾病狀態以及預測治療反應和臨床結局提供了一個潛在的重要臨床工具。因此,對鼻咽癌中表達異常的miRNAs的進一步檢查和驗證將有助于深入了解該病的基本驅動因素,有助于發現新的靶向治療方法。Zou 等[7]發現早期鼻咽癌患者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平顯著高于健康對照組。但是,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p對早期鼻咽癌的聯合診斷尚未有人研究。基于此,本研究旨在探討血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯合檢測對早期鼻咽癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2017年3月至2020年3月我院收治的早期鼻咽癌患者90例為研究組,其中男53例,女37例,平均年齡(52.95±23.01)歲。鼻咽炎患者90例為炎癥組,其中男性50例,女性40例,平均年齡(53.51±22.94)。早期鼻咽癌患者和鼻咽炎患者均經病理確診。排除標準:①抽取血液前接受任何治療的患者;②合并其他腫瘤的患者;③合并全身性自身免疫性疾病;④嚴重心、肝、腎功能損害者;⑤長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者。納入2017年3月至2020年3月至我院體檢的90例健康體檢者為對照組,其中男性45例,女性45例,平均年齡(54.23±24.31)歲。各組一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05),可納入此次分析。受試者均知情同意且獲得我院倫理委員會批準。

1.2 RNA抽取與實時熒光定量PCR

采取90例早期鼻咽癌患者,90例鼻咽炎患者和90例健康體檢者的外周血10 ml。使用北京潤澤康生物科技有限公司的RNA小量提取試劑盒(貨號:R6814-01)進行總RNA的抽取。用特定的逆轉錄(RT)引物和聚合酶鏈反應(PCR)對miRNA進行擴增。RT反應在42 ℃條件下進行60 min,70 ℃條件下進行10 min;PCR反應在95 ℃條件下進行20秒,然后在7900HT實時PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上進行40個循環,95 ℃條件下進行10秒,60 ℃條件下進行20秒,然后70 ℃條件下進行10秒。通過SYBR Green Dye (SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ,TaKaRa,)釋放的熒光水平計算PCR產物的相對量。采用溶解曲線分析方法評價PCR產物的特異性。2-ΔΔCt方法應用于確定miRNA的表達水平。U6作為檢測miRNA相對表達水平的內參基因。引物序列:U6:(Forward primer:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;Reverse primer:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′);miR-140-3P:(Forward primer:5′-GCGCGTACCACAGGGTAGAA-3′;Reverse primer:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′);miR-223-3p:(Forward primer:5'-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3';Reverse primer:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-AGTTGAGTGGGGTAT-3');miR-192-5p:(Forward primer:5′-GGACTTTCTTCATTCACACCG;Reverse primer:5′-GACCACTGAGGTTAGAGCCA)。

1.3 統計學分析

RISM 7.0軟件進行統計分析。采用Mann-Whitney U檢驗評估研究組、炎癥組、對照組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平差異。應用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p檢測早期鼻咽癌的臨床診斷價值。陽性臨界值為ROC曲線中靈敏度-(1-特異度)的最大值所對應的數值。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平

研究組、炎癥組、對照組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平具有顯著差異(P<0.05),并且研究組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平均高于炎癥組和對照組(P<0.05)、炎癥組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平均高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 3組受試人員血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平

2.2 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值

為了評估血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在早期鼻咽癌與鼻咽炎中的診斷價值,繪制90例鼻咽癌患者和90例鼻咽炎的ROC曲線(圖1)。miR-140-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.90±0.03(95%CI 0.8501～0.9531),以miR-140-3p的陽性臨界值1.79,其診斷靈敏度為91%,特異度為90%; miR-192-5p的受試者工作特征曲線的AUC為0.88±0.02(95%CI 0.8427～0.9370),以 miR-192-5p的陽性臨界值2.04,其診斷靈敏度為89%,特異度為90%;miR-223-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.95±0.01(95%CI 0.9284～0.9790),以miR-223-3p的陽性臨界值1.68,其診斷靈敏度為98%,特異度為94%。見圖1和表2。

圖1 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲線

表2 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

2.3 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值

為了評估血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在早期鼻咽癌患者與健康體檢者中的診斷價值,繪制90例鼻咽癌患者和90例健康體檢者的ROC曲線(圖2)。miR-140-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.96±0.02(95%CI 0.9296～0.9926),以miR-140-3p的陽性臨界值1.09,其診斷靈敏度為96%,特異度為95%; miR-192-5p的受試者工作特征曲線的AUC為0.94±0.02(95%CI 0.9009～0.9838),以 miR-192-5p的陽性臨界值1.34,其診斷靈敏度為94%,特異度為95%;miR-223-3p的受試者工作特征曲線的AUC為0.95±0.02(95%CI 0.9059～0.9844),以miR-223-3p的陽性臨界值0.88,其診斷靈敏度為95%,特異度為95%。見圖2和表3。

圖2 兩組血清中miR-140-3p,miR-192-5p,miR-223-3p的ROC曲線

表3 兩組血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

2.4 血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p對早期鼻咽癌的聯合診斷價值

患有早期鼻咽癌的為真陽性,未患有早期鼻咽癌的為真陰性。以miR-140-3p的陽性臨界值1.79、miR-192-5p的陽性臨界值2.04、miR-223-3p的陽性臨界值1.68為診斷標準,三者均滿足為聯合診斷陽性,反之則為聯合診斷陰性。聯合診斷陽性96例(其中病理診斷陽性85例、陰性11例)、陰性174例(其中病理診斷陽性5例、陰性169例)。因此,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯合檢測對早期鼻咽癌的診斷的的靈敏度為94.44%(85/90),特異度為93.89%(169/180),準確度為94.07%(254/270)。

3 討論

鼻咽癌由于病變隱匿且早期癥狀不典型,很難早期發現和診斷。大約70%～80%的鼻咽癌患者在診斷時出現頸部淋巴結轉移甚至是遠處轉移,這成為限制患者生存的重要因素。同時,有相當一部分鼻咽癌患者直到病情發展到晚期才被發現,導致其預后差,臨床治療效果不理想[8-9]。因此,有效的預防和預測策略是減輕鼻咽癌負擔的關鍵。越來越多的證據表明miRNAs可能通過調控靶基因在鼻咽癌的發生中發揮重要作用。可以在血漿或血清中穩定檢測到的miRNA已被證明是多種癌癥類型生物標志物的穩定來源[10]。在本研究中,我們基于實時熒光定量PCR對90例早期鼻咽癌患者、90例鼻咽炎患者、90例健康體檢者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的檢測和ROC曲線分析,發現血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p聯合對早期鼻咽癌的診斷的靈敏度為94.44%,特異度為93.89%,準確度為94.07%。

越來越多的證據表明,miRNA與癌癥生物學過程有著密切的關系[11]。miRNA作為潛在的生物標志物在包括鼻咽癌在內的各種癌癥類型中具有特殊的意義[12]。與其他分子標記相比,血清中miRNA具有穩定、易于測量、樣品采集過程簡單、檢測技術成熟等優點[13-14]。miR-140-3p對肺癌腫瘤細胞生長和侵襲有正向作用[15]。也發現其與非小細胞肺癌中miR-140/PD-L1/cyclin E通路相關,這為腫瘤免疫治療帶來了新的靶點[16]。在本研究中,發現研究組、炎癥組、對照組血清中miR-140-3p的表達水平具有顯著差異(P<0.05),并且研究組血清中miR-140-3p的水平均高于炎癥組合對照組。因此,我們推測其在鼻咽癌患者血清中的上調可能導致腫瘤抑制功能的缺失。miR-192-5p在肝癌、胃癌和神經母細胞瘤等多種癌癥中被發現上調[17]。據報道[18],它是通過調節細胞周期通路中的關鍵因子(如Dicer1)而成為腫瘤啟動子。然而,在其他一些癌癥如結直腸癌中,它經常被發現具有下調、反向抑制作用。研究發現[19],miR-192-5p通過直接靶向USP1抑制骨肉瘤的起始和進展。在本研究中,發現研究組、炎癥組、對照組血清中miR-192-5p的表達水平具有顯著差異(P<0.05),并且研究組血清中miR-192-5p的水平均高于炎癥組合對照組。其在不同腫瘤中的復制性揭示了miR-192-5p生物學功能的復雜性。據報道[20],MiR-223-3p在卵巢癌中過表達,體外過表達MiR-223-3p通過調節性別決定區Y-box 11促進細胞增殖、遷移和侵襲。研究發現[21],miR-223-3p在DU-145和LNCaP細胞中的表達降低會降低多西紫杉醇的IC50值并提高細胞凋亡率,這表明miR-223-3p抑制劑可提高DU-145和LNCaP對多西紫杉醇的化學敏感性。因此,miR-223-3p可能是一個抗化療因子。在化療的同時,在合適的呈遞系統的情況下,給鼻咽癌患者給予miR-223-3p inhibitor的治療可能會提高化療的效果。此外,雖然大多數miRNA是胞內的,但細胞外miRNA的穩定表達譜提示miRNA不僅可以被動地向外釋放,還可以以某些特定的方式主動轉運,從而導致表達失衡。

然而,本研究仍然有不足之處。為了擴大已識別的miRNA在血清中的診斷應用,需要進一步探索了具有不同臨床病理特征的鼻咽癌患者血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達。例如,EBV感染是鼻咽癌發生的誘因之一[22]。愛因斯坦-巴爾病毒(EBV)在病因上與霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,胃癌和鼻咽癌等幾種癌癥相關,是第一個報道的人類腫瘤病毒。EBV的攜帶感染率高達90%,但只有少數人會感染鼻咽癌。因此,有理由認為不同的miRNA表達模式可能參與了鼻咽癌中某些EBV相關的生物學過程,將鼻咽癌患者分為EBV陽性和EBV陰性后值得進一步探討血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p在此兩組患者中的表達差異。

綜上所述,血清中miR-140-3p、miR-192-5p、miR-223-3p的表達水平檢測可作為早期鼻咽癌的潛在標志。