ADAMTS19在子宮內膜癌組織中的表達及其意義

石 巍 王亞蘋 田 赟

子宮內膜癌(endometrial cancer,EC)是子宮內膜的上皮性惡性腫瘤,在我國的發(fā)生率僅次于宮頸癌[1]。以往子宮內膜癌治療多采用手術及放化療等[2]。近年來,關于該疾病的分子機制和靶向治療逐漸成為研究熱點。有研究表明含血小板反應蛋白的解聚素樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin,ADAMTS)家族共有19個成員[3],ADAMTS家族成員的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。ADAMTS家族的成員,如ADAMTS2、ADAMTS5、ADAMTS12和ADAMTS15均已證實可作為抑癌或者促癌因子[5-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)在胃腸道腫瘤中,ADAMTS19的表觀遺傳失活可以促進結直腸癌的轉移和擴散[9]。然而,ADAMTS19在子宮內膜癌中表達及作用機制尚未報道。本研究擬通過檢測子宮內膜癌組織中ADAMTS19的表達,并探討其臨床意義,為疾病靶向治療提供一個新的思路[10]。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選擇2017年1月至2019年12月于我院就診的子宮內膜患者39例,分別取新鮮癌組織和對應癌旁組織(距離癌組織大于3 cm),所有標本術后病理證實為子宮內膜樣腺癌及癌旁組織,診斷至少由兩名獨立的經(jīng)驗豐富的病理學專家完成。根據(jù)子宮內膜癌診斷與治療指南(2021年版)標準確定子宮內膜癌FIGO分期。入選患者中無應用激素類藥物者、無合并其他惡性腫瘤者、無合并自身免疫性疾病者和未行放、化療者。所有組織離體后,迅速置于-80 ℃冰箱保存,并取石蠟切片子宮內膜癌和對應癌旁組織各10例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象均自愿參加。

1.2 細胞

Ishikawa細胞購自中科院協(xié)和細胞庫。

1.3 主要試劑

兔抗人ADAMTS19、p-STAT3抗體購自美國Abcam公司,免疫組化試劑盒購自中杉金橋生物科技有限公司,lipofectamine3000、Trizol試劑購自賽默飛世爾科技有限公司,qRT-PCR試劑盒購自上海東洋紡生物科技有限公司,CCK8試劑盒購自日本同仁公司,引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化(IHC)檢測ADAMTS19蛋白的表達將標本固定、脫水、石蠟包埋,以4 μm為標準連續(xù)切片,應用二甲苯脫蠟,酒精脫水,3%H2O2去除內源性過氧化物酶,檸檬酸抗原修復。然后根據(jù)SP法對石蠟標本進行一抗(兔抗人ADAMTS19抗體)、二抗孵育,顯色,封片。光學顯微鏡下觀察染色。用Image J軟件評價染色強度,結果用陽性細胞的平均灰度值和陽性面積百分比表示。

1.4.2 qRT-PCR檢測ADAMTS19 mRNA的表達量 qRT-PCR檢測子宮內膜癌及癌旁組織中ADAMTS19的mRNA水平表達情況。用消毒過的鋼珠在組織勻漿儀中研磨組織,按照Trizol的說明書逐步提取總RNA,利用NanoDrop檢測樣品中的RNA濃度和純度,將RNA反轉錄合成cDNA,反應參數(shù)為:37 ℃ 15 min;50 ℃ 5 min;98 ℃ 5 min。SYBR熒光定量試劑盒中每孔20 μL,95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,65 ℃延伸15 s,共40個循環(huán)。qRT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司設計完成(表1)。用2-△△Ct法記錄各樣本表達量。

1.4.3 細胞培養(yǎng)與轉染 用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Ishikawa細胞(簡稱“完全培養(yǎng)基”),置于37 ℃的 5% CO2培養(yǎng)箱中,根據(jù)lipofectamine3000說明書進行實驗操作,共設計三條si-RNA,即si#1、si#2和si#3。24 h后提取總RNA,使用qRT-PCR檢測ADAMTS19的mRNA表達,篩選干擾效率最好的一個的用于后續(xù)試驗。

1.4.4 CCK-8檢測細胞增殖 在96孔板中接種Ishikawa細胞5×103個/孔,加入100 μL培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,分別用NC(對照組)和干擾效率最佳的ADAMTS19-siRNA進行轉染。在轉染0 h、24 h、48 h、72 h后,每孔加入CCK-8 10 μL,置于體積分數(shù)為5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中2 h,于450 nm處檢測光密度。

1.4.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 在6孔板中接種Ishikawa細胞4×105個/孔,加入培養(yǎng)液2 mL,待細胞完全貼壁后轉染24 h,將ADAMTS19沉默組和NC組分別用200 μL槍頭在6孔板底部劃一條線,再垂直它劃一條直線,PBS沖洗3次,添加新培養(yǎng)基,在劃痕0 h、24 h和48 h時拍照記錄。用Image J劃線法計算遷移距離。

1.4.6 transwell檢測細胞侵襲能力 4 ℃完全融化Matrigel膠,按照1∶8稀釋混勻后在transwell上室每孔加入50 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中過夜使其充分凝固成膜,加入200 μL培養(yǎng)基水化基質膠,37 ℃ 15 min后棄去培養(yǎng)基。收集轉染24 h后的細胞,下室中加10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL孵育48 h。固定、染色,顯微鏡下每個小室取3個視野的平均細胞數(shù)判讀。

1.4.7 蛋白質印跡法(Western blot)檢測ADAMTS19蛋白的表達水平 ADAMTS19 si-RNA組、NC組細胞培養(yǎng)48 h后棄去廢液,PBS洗三遍后加入裂解液,充分混勻后置于冰上裂解30 min,12000 r/min離心10 min,收集蛋白上清。用BCA法檢測蛋白濃度。上樣時每孔中加蛋白50 μg,80 V初始電泳,后改為120 V。4 ℃恒流100 mA下,蛋白轉膜90 min。5%脫脂奶粉中孵育2 h,加一抗(1∶1000,4 ℃過夜)、二抗(1∶20000,37 ℃ 90 min),ECL顯色試劑盒顯色,以β-actin為內參,用Image J軟件分析目的蛋白的表達量。

1.4.8 Western blot檢測p-STAT3蛋白的表達水平 ADAMTS19 si-RNA組、NC組細胞培養(yǎng)48 h后,按1.4.7中Western blot方法檢測細胞中p-STAT3的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 子宮內膜癌組織中ADAMTS19蛋白表達低于癌旁組織

ADAMTS19蛋白主要表達于細胞質中,顯微鏡下呈棕黃色、顆粒狀分布。對子宮內膜癌組織和癌旁組織中ADAMTS19蛋白表達進行分析,結果提示,子宮內膜癌組織中ADAMTS19的平均表達水平為(1.05±0.68),對應癌旁組織為(3.52±1.56),差異有統(tǒng)計學意義(T=4.227,P<0.001)。

2.2 ADAMTS19 mRNA在子宮內膜癌組織中呈低表達

qRT-PCR檢測39對子宮內膜癌組織和癌旁組織中ADAMTS19的表達情況,結果表明子宮內膜癌組織和癌旁組織中的ADAMTS19 mRNA表達分別為(0.02±0.03)和(0.11±0.16),ADAMTS19在子宮內膜癌組織中的表達顯著低于癌旁組織,且差異具有統(tǒng)計學意義(圖1,T=3.833,P<0.001)。

圖1 ADAMTS19在子宮內膜癌組織及癌旁組織中的表達

2.3 ADAMTS19表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系

以子宮內膜癌組織中ADAMTS19 mRNA表達中位值作為截斷點,將患者分為高表達組(n=19例)和低表達組(n=20例)。對ADAMTS19表達與其臨床參數(shù)的相關性進行分析。結果表明,ADAMTS19的表達水平與子宮內膜癌FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤組織分化程度密切相關(P<0.05),而與患者年齡、BMI、是否絕經(jīng)無明顯相關(P>0.05),見表2。

表2 子宮內膜癌組織中ADAMTS19表達與其臨床病理參數(shù)的關系/例

2.4 檢測ADAMTS19 si-RNA轉染Ishikawa細胞的最佳效率

實驗組為轉染ADAMTS19 si#1、si#2、si#3的三組細胞,陰性對照組為轉染NC的細胞。轉染24 h后NC組、si#1組、si#2組和si#3組中ADAMTS19相對表達量分別為(4.18±0.13)、(1.00±0.82)、(2.43±0.29)、(3.80±0.12)(表3),與陰性對照組相比,轉染si#1的細胞中ADAMTS19的表達水平降低最為明顯,且差異具有統(tǒng)計學意義(圖2,T=35.630,P<0.001)。因此選擇si#1用于細胞功能實驗的相關研究。

圖2 轉染后各組細胞ADAMTS19表達情況

表3 不同組細胞中ADAMTS19的相對表達量

2.5 沉默ADAMTS19能顯著促進Ishikawa細胞的增殖能力

用酶標儀在450nm處測定si#1組和NC組細胞的吸光度,結果提示:轉染si#1的實驗組中細胞的增殖能力較對照組明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(圖3,P<0.001),提示沉默ADAMTS19可促進Ishikawa細胞的增殖能力。

圖3 ADAMTS19對Ishikawa細胞增殖能力影響

2.6 沉默ADAMTS19能顯著增強Ishikawa細胞的遷移能力

轉染培養(yǎng)48 h后,si#1組劃痕寬度明顯比對照組寬度窄,差異有統(tǒng)計學意義(圖4,T=7.706,P=0.002),表明沉默ADAMTS19可以促進Ishikawa細胞的遷移能力。

圖4 ADAMTS19對子宮內膜癌Ishikawa細胞遷移能力的影響

2.7 沉默ADAMTS19能顯著增強Ishikawa細胞的侵襲能力

與NC組比較,轉染si#1的實驗組穿膜細胞數(shù)量明顯增加(圖5);NC組與轉染si#1的實驗組細胞平均穿膜細胞數(shù)分別為(94.33±4.73),(908.33±33.61),差異具有統(tǒng)計學意義(T=41.550,P<0.001)。提示沉默ADAMTS19可以促進Ishikawa細胞的侵襲能力。

圖5 沉默ADAMTS19后Ishikawa細胞侵襲情況(400×)

2.8 沉默ADAMTS19后p-STAT3蛋白表達明顯增高

si#1組細胞中p-STAT3蛋白表達水平較NC組明顯上調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖6)。

圖6 沉默ADAMTS19后細胞中p-STAT3蛋白表達情況

3 討論

研究表明[11],ADAMTS的家族成員由19個分泌型多結構域鋅指金屬蛋白酶組成,能參與機體多種過程,如凝血、關節(jié)炎和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。已有文獻報道[12-13],ADAMTS家族成員可以參與多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ADAMTS家族的成員可作為癌癥抑制因子或啟動子,該家族已成為腫瘤研究的熱點方向。研究證實:在結直腸癌中,ADAMTS的表達下調,且與不良預后相關[14];ADAMTS18的低表達與子宮內膜癌不良預后密切相關,且在體外具有抗腫瘤增生能力[15];ADAMTS5在口腔鱗狀細胞癌中呈高表達,且與腫瘤病例分化程度有關,是潛在的口腔鱗癌治療靶點[16]。然而,迄今為止,子宮內膜癌中ADAMTS19的表達情況及機制仍是未知的。

已有不少研究證實,多個表觀遺傳學相關分子與子宮內膜癌有關,相應的靶向藥物也為治療提供新的方法和手段,同時研究新的生物學標志物和探索靶點對子宮內膜癌的治療有一定的指導意義。本文擬研究ADAMTS19在子宮內膜癌中的表達、生物學作用及其意義。通過qRT-PCR和免疫組化方法對臨床樣本分析結果證實:在子宮內膜癌組織中的ADAMTS19表達較癌旁組織中明顯降低,提示低表達的ADAMTS19可能與子宮內膜癌密切相關;且通過分析發(fā)現(xiàn)ADAMTS19的低表達與子宮內膜癌患者FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤組織的分化程度密切相關。體外實驗表明:沉默ADAMTS19后Ishikawa細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增強,表明ADAMTS19在子宮內膜癌的形成與演變過程中起重要作用,參與了子宮內膜的惡性轉化、侵襲和轉移過程;提示ADAMTS19有望成為預測子宮內膜癌及監(jiān)測腫瘤疾病進展的生物標志物,并為靶向治療提供新思路。

細胞質中轉錄激活因子(STAT)蛋白家族包括七個轉錄因子,其中STAT3被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵因素之一[17]。STAT3有兩種存在形式,一種是以二聚體的形式存在,穩(wěn)定且難以降解,另一種是磷酸化的STAT3(p-STAT3)[18]。在細胞質中,STAT3可以被Janus磷酸化為p-STAT3。p-STAT3進入細胞核后可以促進腫瘤細胞增殖,耐藥,或抑制腫瘤細胞凋亡[19]。已經(jīng)有研究證實,p-STAT3過表達與胃癌[20]、直腸癌[21]等患者的不良預后有關。本研究中,沉默ADAMTS19后p-STAT3蛋白表達明顯上調,推測ADAMTS19可能是通過激活p-STAT3信號通路,引起p-STAT3蛋白表達增多,引起子宮內膜癌細胞的增殖與轉移,從而促進子宮內膜癌的發(fā)展。

綜上所述,本研究首次探討ADAMTS19在子宮內膜癌中的表達及其意義,證實ADAMTS19在子宮內膜癌組織中呈低表達,沉默ADAMTS19可以促進Ishikawa細胞的體外增殖、侵襲和遷移;且ADAMTS19的低表達與子宮內膜癌患者FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤組織的分化程度密切相關;提示ADAMTS19的表達下調與子宮內膜癌的發(fā)生與疾病進展密切相關。但本實驗樣本量相對較少,后續(xù)研究需加大樣本量,并進一步從基因層面深入研究ADAMTS19在子宮內膜癌中的發(fā)病機制。