外泌體介導miR-3473b靶向NF-κB對肺癌細胞肺內轉移及B細胞數量的影響

李馮洋

肺癌為目前全球主要癌癥發病和死亡原因之一。據2018全球癌癥統計數據顯示,全球癌癥發病率約為236.9/10萬,死亡率約為125.2/10萬,其中肺癌發病率和死亡率均位居首位[1]。遠處轉移為肺癌常見擴散方式,亦是患者復發和死亡的主要原因之一。肺癌肺內轉移是指在原發腫瘤外肺部出現的腫瘤,此時患者多處于晚期,預后較差[2]。近年研究發現,腫瘤細胞來源外泌體可誘導轉移靶器官形成轉移前微環境,并在循環腫瘤細胞定植后促進生成腫瘤血管,進而參與腫瘤轉移過程[3]。除蛋白質外,外泌體miRNA在包括肺癌在內的大多數腫瘤進展過程中亦起到關鍵性作用[4]。Kim等[5]研究發現,腫瘤源性外泌體miR-619-5p可通過調節RCAN1.4,促進非小細胞肺癌細胞增殖和轉移。目前國內為尚缺乏對肺癌細胞源性外泌體miR-3473b對肺癌細胞肺內轉移及B細胞數量的影響的研究。本研究對此進行分析,旨在為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及動物

小鼠肺癌細胞(LLC):購自上海撫生實業有限公司,貨號FS-0291。C57BL/6小鼠:80只,SPF級,雌雄各半,購自南京君科生物工程有限公司,貨號J006,周齡6～8周,體重110～120 g,自由飲食飲水,溫度(21±2)℃,濕度30%～70%,光照周期12/12小時。肺成纖維細胞:分離自C57BL/6小鼠肺組織。細胞均置于含10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素的DMEM高糖培養基(大連美侖生物技術有限公司,貨號MA0212)中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2 主要試劑與儀器

外泌體提取及miRNA檢測:由上海宇玫博生物科技有限公司完成。碳支持膜(貨號AGS160H):英國Agar Scientific公司。3%磷鎢酸負染液(貨號G1871)、Cy5.5染料(貨號S1061)、膠原酶Ⅳ(貨號C8160)、ECL化學發光法檢測試劑盒(貨號SW2010)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、反轉錄試劑盒(貨號RP1200):北京索萊寶科技有限公司。α-SMA(貨號HL80016):上海哈靈生物科技有限公司。DAPI染色液(貨號abs47047616):上海愛必信生物科技有限公司。BCA蛋白定量分析試劑盒(貨號23221):美國賽默飛世爾公司。膜封閉液(貨號SL1330):北京酷來搏科技有限公司。小鼠抗CD63單克隆抗體(貨號D198650):上海生工生物股份有限公司。小鼠抗Hsp90單克隆抗體(貨號AH732):上海碧云天生物技術有限公司。TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(貨號RR820A):新疆寶信生物技術有限公司。共聚焦顯微鏡(型號Auto 2):美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 LLC來源外泌體鑒定及行蹤 分離與鑒定:待LLC細胞生長融合度達80%時,更換無外泌體血清DMEM高糖培養基;24 h后收集細胞上清液,室溫以2000 g離心30 min,取上清液移至新離心管,冰上保存;加入1/3體積外泌體提取試劑,4 ℃過夜;次日吸取2 mL液體于新離心管,4 ℃下以1500 g離心30 min,棄上清液;再次吸取2 mL液體于同一離心管,重復離心,直至所有液體均被吸取;取10 μL樣品于封口膜上,上方放置碳支持膜,吸附制樣;后將碳支持膜懸浮于3%磷鎢酸負染液復染3 min,干燥后,透射電鏡下觀察外泌體大小及形態。細胞攝取:將Cy5.5染料與LLC來源外泌體混合,經尾靜脈注射至小鼠體內;24 h后收集肺組織,制作組織切片,以α-SMA染色;加入膠原酶Ⅳ,收集肺成纖維細胞;將肺成纖維細胞接種于共聚焦培養皿中,2×105個/孔,加入Cy5.5標記的LLC來源外泌體;3 h后棄去上清,以PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;室溫下以多聚甲醛固定10 min,PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;加入DAPI染色液,室溫孵育10 min;PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;加入1 mL的PBS緩沖液,共聚焦顯微鏡下觀察LLC來源外泌體行蹤。外泌體標記蛋白表達:采用蛋白免疫印跡法。取LLC細胞,加入RIPA裂解液裂解30 min,按照BCA蛋白定量分析試劑盒說明書操作,檢測相應蛋白濃度;10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解產物后,轉移至PVDF膜上,加入膜封閉液,室溫封閉1 h;分別滴加CD63和Hsp90抗體,4 ℃過夜;TBST沖洗3次,每次5 min;滴加HRP標記相應二抗,室溫孵育1 h;TBST沖洗3次,每次5 min;按照ECL化學發光法檢測試劑盒說明書操作,凝膠成像系統分析目的條帶分子量及光密度值。

1.3.2 細胞內及外泌體內miR-3473b表達 采用RT-PCR法。提取細胞RNA和外泌體miRNA,按照反轉錄試劑盒說明書操作,將RNA反轉錄為cDNA;引物序列,miR-3473b上游引物:5＇-GCGGGCTGGAGAGATG-3＇,下游引物:5＇-GTGCAGGGTCCGAGGT-3＇;反應體系:上游和下游引物各8 μL,TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL,cDNA 2 μL,4 ℃離心(1500 rpm)1 min,每孔設置3個復孔;反應條件:95 ℃預變性30 s(1個循環),95 ℃變性5 s(30個循環),60 ℃退火和延伸30 s(30個循環);取8 μL PCR產物,加2 μL 5×Loading Buffer,混勻后置于2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色后,凝膠成像系統進行定量分析。

1.3.3 LLC來源外泌體對小鼠肺內轉移及B細胞數量的影響 尾靜脈注射LLC來源外泌體,10 μg/20 g·次,1次/3 d;6 d后,尾靜脈注射LLC細胞,5×105個,繼續注射LLC來源外泌體3次,以及miR-3473b抑制劑6次;22 d后處死小鼠,收集肺組織,采用HE染色法觀察小鼠肺轉移數目及面積,流式細胞術分析肺部B細胞數量。

1.3.4 LLC來源外泌體miR-3473b對肺成纖維細胞NF-κB通路的影響 應用蛋白免疫印跡法。方法同1.3.1中外泌體標記蛋白檢測步驟。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 LLC來源外泌體鑒定及行蹤

透射電子顯微鏡顯示,LLC來源外泌體微囊泡直徑為30～100 nm,占80%以上(圖1A);LLC來源外泌體微囊泡中Hsp90、CD63呈陽性表達(圖1B);將Cy5.5標記的LLC來源外泌體加入成纖維細胞4 h后,LLC來源外泌體(綠色熒光顆粒)可被細胞攝取(圖1C)。

A為LLC來源外泌體大小和形態(箭頭所示);B為外泌體標志物Hsp90、CD63表達(蛋白免疫印跡);C為成纖維細胞對Cy5.5標記的外泌體攝取情況(免疫熒光)。

2.2 細胞內及外泌體內miR-3473b表達

LLC來源外泌體內miR-3473b表達水平顯著高于細胞內(t=5.498,P<0.01),見圖2。

圖2 細胞內及外泌體內miR-3473b表達

2.3 LLC來源外泌體miR-3473b對小鼠肺內轉移的影響

LLC來源外泌體組小鼠肺轉移數目及面積顯著多于對照組(P<0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b組與LLC來源外泌體組小鼠肺轉移數目及面積比較,差異無統計學意義(P>0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組小鼠肺轉移數目及面積顯著低于LLC來源外泌體組(P<0.05),見圖3。

A為小鼠肺轉移數量比較;B為小鼠肺轉移面積比較。

2.4 LLC來源外泌體miR-3473b對小鼠肺內B細胞數量的影響

LLC來源外泌體組小鼠肺內CD45+標記免疫細胞中B細胞百分比顯著高于對照組(P<0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b組與LLC來源外泌體組小鼠肺內CD45+標記免疫細胞中B細胞百分比比較,差異無統計學意義(P>0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組小鼠肺內CD45+標記免疫細胞中B細胞百分比顯著低于LLC來源外泌體組(P<0.05),見圖4。

圖4 LLC來源外泌體miR-3473b對小鼠肺內B細胞數量的影響

2.5 LLC來源外泌體miR-3473b對肺成纖維細胞NF-κB通路的影響

LLC來源外泌體組小鼠成纖維細胞p65和p-p65水平顯著高于對照組,Nfkbid水平顯著低于對照組(P<0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b組與LLC來源外泌體組小鼠成纖維細胞p65、p-p65及Nfkbid水平比較,差異無統計學意義(P>0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組小鼠成纖維細胞p65和p-p65水平顯著低于LLC來源外泌體組,Nfkbid水平顯著高于對照組(P<0.05),見圖5。

A為對照組;B為LLC來源外泌體組;C為LLC來源外泌體+miR-3473b組;D為LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組。

3 討論

外泌體為直徑為40～100 nm的盤狀囊泡,包括腫瘤細胞在內的多種細胞均可分泌。腫瘤微環境中,外泌體為細胞間通訊及遺傳物質傳遞的重要載體,參與了腫瘤細胞生長、增殖、轉移等生物學行為。Huang等[6]研究發現,非小細胞肺癌來源外泌體可通過傳遞α-平滑肌肌動蛋白,促進正常肺成纖維細胞和非小細胞肺癌細胞增殖和抑制細胞凋亡。外泌體中包含RNA、miRNA、DNA等多種成分。近年研究表明,外泌體miRNA在肺癌新生血管生成、細胞轉移、免疫調節等方面發揮重要作用[7]。miR-3473b在腫瘤進展中作用尚未完全明確。Wang等[8]研究發現,小鼠大腦中動脈短暫性閉塞后,腦皮質和紋狀體中miR-3473b表達顯著上調,miR-3473b可通過增強卒中后神經炎癥損傷,促進卒中發病。表明miR-3473b可能與炎癥反應發生有關。NF-κB信號通路為炎癥反應啟動的經典通路之一。研究表明,NF-κB信號通路在介導肺癌炎癥反應及細胞生長、增殖及轉移中有著重要意義[9]。Shen等[10]從胃癌AGS細胞中提取外泌體,并與間充質干細胞培養發現,胃癌細胞來源外泌體可通過激活NF-κB信號通路,增強間充質干細胞激活免疫細胞、維持炎癥環境、支持腫瘤生長的能力。

本研究首先對LLC提取的外泌體形態學及標志物鑒定發現,肺癌源性外泌體微囊泡直徑為30～100 nm,占80%以上,且微囊泡中Hsp90、CD63呈陽性表達,與以往報道的肺癌源性外泌體相符[11]。既往研究表明,成纖維細胞為攝取肺內外泌體主要細胞之一[12]。本研究將Cy5.5標記的LLC來源外泌體加入α-SMA+成纖維細胞4 h后發現,LLC來源外泌體可被細胞攝取,提示LLC來源外泌體可被肺成纖維細胞吸收。后經RT-PCR反應發現,LLC來源外泌體內miR-3473b表達水平顯著高于細胞內,提示外泌體miR-3473b參與調控肺癌細胞生物學行為。劉艷芳等[13]研究發現,腫瘤源性外泌體可通過激活肺上皮細胞Toll樣受體3表達,促進肺轉移前微環境形成。朱萌等[14]研究發現,低分化胃癌細胞來源外泌體可通過轉運miR-106a影響胃癌腹膜轉移。本研究發現,LLC來源外泌體可促進肺癌細胞肺內定植,注射miR-3473b抑制劑后,肺癌細胞肺內定植顯著減少,提示miR-3473b抑制劑可減少肺癌細胞肺內定植,可能與抑制肺癌細胞增殖和轉移有關,具體機制還需進一步探討。B細胞為體液免疫主要細胞之一,可通過分泌抗體發揮免疫效應。研究顯示,B細胞可誘導非保護性體液免疫,并可通過減弱體內CD4+、CD8+T細胞反應,促進癌細胞轉移[15]。本研究發現,LLC來源外泌體可誘導肺內B細胞聚集,可能與減弱T細胞反應有關,注射miR-3473b抑制劑后,肺內B細胞聚集情況顯著減輕,提示通過抑制LLC來源外泌體miR-3473b表達,可顯著降低B細胞在肺內聚集,有可能可增加癌癥免疫治療療效。另本研究還發現,LLC來源外泌體可顯著抑制肺成纖維細胞Nfkbid表達,并靶向激活NF-κB信號通路,提示NF-κB信號通路在LLC來源外泌體miR-3473b介導的免疫應答可能發揮重要作用。

綜上所述,外泌體介導miR-3473b可能通過抑制肺成纖維細胞Nfkbid表達,靶向激活NF-κB信號通路,促進肺癌細胞肺內轉移以及誘導肺內B細胞聚集。