寡肽轉運蛋白PEPT1靶點的口服藥物設計研究進展

胡珊，張文锍，孫勇兵，雷銘道，胡律江

（1.江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.江西省婦幼保健院藥學科，江西 南昌 330006）

在胃腸道上皮細胞中表達著很多轉運蛋白，這些轉運蛋白在藥物和食物消化吸收進入血液循環過程中發揮著重要作用。在這些眾多的藥物轉運蛋白中，寡肽轉運蛋白1（Peptide transporter 1，PEPT1）是目前藥物轉運蛋白中研究最深入和應用最廣泛的轉運蛋白，它的主要功能是介導二肽、三肽和一些擬肽類藥物的口服攝取和轉運[1]。由于轉運蛋白主要表達在各種組織細胞膜上，所以影響著藥物的吸收、分布，在藥物體內藥動學行為中起著關鍵作用[2]。通常把寡肽轉運蛋白劃分定位在上皮細胞刷狀緣側和定位在上皮細胞基底側膜的寡肽轉運蛋白兩類，在這兩類寡肽轉運蛋白協同作用下寡肽和擬肽類藥物完成了由腔道側向血液側完整的跨上皮細胞吸收過程。

PEPT1主要分布于小腸上皮細胞，此外，在眼部血液-房水屏障和血液-視網膜屏障、肝外上膽管皮細胞頂膜、腎臟近端小管處亦有少量的PEPT1 表達。20 世紀90 年代中期，PEPT1 和PEPT2（基因代碼分別為SLC15A1和SLC15A2）這兩種頂側膜的寡肽轉運蛋白被鑒定出來，PEPT2 主要表達在腎臟上皮細胞的頂側膜端。但是基底膜的寡肽轉運蛋白目前仍未被克隆出來。本文綜述了有關肽轉運蛋白PEPT1 的最新研究進展，以期為后續對PEPT1的研究提供思路和參考。

1 PEPT1的生物學特征和底物結構分析

1.1 PEPT1的生物學特征

1994 年，Fei 從兔小腸中首次克隆了PEPT1，1995年人小腸寡肽轉運蛋白（hPEPT1）也被成功克隆。hPEPT1（基因代碼為SLC15A1）含有708 個氨基酸殘基，在小腸有豐富的表達，并定位于小腸上皮細胞的刷狀緣側，在小腸近端到遠端方向上表達水平漸增。人寡肽轉運蛋白最重要的亞型PEPT2 在小腸內沒有表達，主要表達在腎臟細胞，重吸收尿液中的寡肽和擬肽類藥物進入血液循環。PEPT1 使用細胞內外H+濃度梯度差和負的膜電位作為轉運底物的能量來源。2011年，牛津大學的結構生物學家Newstead 教授首次解析了來源于希瓦氏菌（Shewanelle oneidensis）PEPTSo 的三維晶體結構[3]，并且發現PEPT1 采用交替通路模式（Alternating access）轉運底物，這大大提高了對PEPT1功能和轉運機制的認識[4-6]。PEPT1 屬于主要協同轉運超家族（major facilitator family，MFS）。

1.2 PEPT1的底物結構分析

肽鍵一般被認為是PEPT1 識別底物的重要官能團。但實際研究發現，肽鍵、氨基和羧基并不都是PEPT1 識別底物所必需的[7-8]，如5-氨基乙酰丙酸沒有肽鍵，頭孢克肟（cefixime）沒有氨基端，伐昔洛韋沒有肽鍵和羧基端[9]，但是它們都能被PEPT1 識別和轉運，只是底物如果沒有肽鍵、氨基和羧基這些基團，它們與PEPT1 的親和力可能會降低[10]；具有氨基端的氨基青霉素和氨基頭孢菌類與PEPT1 有很高的親和力，這兩個藥物的跨膜轉運速率和口服生物利用度都很高[11]。一般來說，與三肽相比，由2 個L-氨基酸組成的二肽與PEPT1 之間的親和力（affinity）更好，N-端或C-端取代基的體積大小和底物大小對PEPT1 介導的轉運也有顯著影響[12]。具有疏水性側鏈的寡肽顯示出與PEPT1更高的親和力。

PEPT1屬于低親和力、高轉運能力的轉運系統，即米氏常數Km 和Vm 都比較大，這非常有利于PEPT1對底物的腸吸收，因為腸道內高濃度的底物不易將轉運能力達到飽和。PEPT1的底物非常廣泛，包括二肽、三肽化合物和一些擬肽類藥物（peptidomimetics）。β-內酰胺類抗生素如頭孢羥氨芐、阿莫西林，血管緊張素轉化酶抑制劑如福辛普利、依那普利，多巴胺受體抑制劑，腎素抑制劑，抗腫瘤藥物或抗病毒藥物如貝他定、伐昔洛韋等都是PEPT1的底物。

PEPT1介導的轉運具有明顯的立體選擇性。在結合并轉運寡肽過程中，PEPT1 對含有L-氨基酸殘基的寡肽比含有一個或多個D-氨基酸殘基的寡肽具有較高的親和力。阿昔洛韋、阿糖胞苷、地西他濱等藥物的L-纈氨酸前藥與PEPT1 的親和力明顯高于相應的D-纈氨酸。

2 PEPT1的三維蛋白結構分析

隨著結構生物學的發展，PEPT1 和PEPT2 的蛋白晶體結構逐漸被解析出來，這大大促進了對寡肽轉運蛋白轉運機制的認識。來源于希瓦氏菌（Shewanelle oneidensis）PEPTSo的三維晶體結構于2011 年被解析出來（圖1）[3]，其后很多不同來源的PEPT的三維空間結構被解析，這些三維結構都是蛋白和底物（ligand）結合在一起的狀態下測定的，如表1 所示。2021 年，人PEPT2 的三維晶體結構被解析出來，但到目前為止人PEPT1 的三維晶體結構尚未被解析出來。通過對PEPT1 三維晶體結構的分析，利用計算機輔助藥物設計手段，可以設計更好的底物分子來提高一些難吸收藥物的口服生物利用度。

圖1 PEPTSo的三維晶體結構［3］Figure1 Three-dimensional crystal structure of PEPTSO

表1 已經報道的POT家族寡肽轉運蛋白的晶體結構Table1 The crystal structure of the reported POT family oligopeptide transporters

三維晶體研究發現，PEPT1 由分別折疊成N-和C-兩個結構域的12 次跨膜螺旋（Transmembrane helices）組成，每個結構域含有6 個跨膜螺旋，即TM1～6 組成N-結構域（N-hundle），TM7～12 組成C-結構域（Nhundle，圖1）。底物結合口袋（substrate-binding cavity）位于N-結構域和C-結構域之間，處于整個蛋白靠近中心的位置。PEPT1 采取交替通路模式進行底物的轉運，在一個完整的轉運過程中，轉運蛋白會經歷4 種構象的變化，即開口向外（outward open）、填充態（latteral occluded）、開口向內（inward open）和豎直填充（verti‐cal occluded），最終將底物轉運進入細胞內部（圖2）[3]。

圖2 PEPT1的交替通路模式[3]Figure 2 The alternate path for PEPT1

3 以PEPT1為靶點的前體藥物設計

口服給藥由于給藥方便，病人的順應性高，因此最受患者的歡迎，也是目前最主要的給藥途徑，在歐美等發達國家最暢銷的50 種藥品中84%是口服制劑。但是口服給藥的開發受到越來越大的挑戰?，F代組合化學和高通量篩選技術的結合雖然發現了很多新的具有很好藥理活性的先導化合物（new chemical entity，NCE），但是早期對藥動學性質評價的忽略，可能會出現口服生物利用度低且差異大的現象，使得最終藥物分子并不適合口服這種便捷的給藥形式。統計數據顯示，藥物研究中有40%的候選藥物是由于藥動學參數不佳導致體內無活性而遭到淘汰。因此，有必要改善藥物的口服生物利用度，以提高新藥開發的成功率并滿足臨床要求。

由于PEPT1 對底物結構的高耐受性和底物識別的多專屬性可以識別廣泛范圍內的不同大小、疏水性和荷電的藥物分子，使得以PEPT1 為靶點設計載體前藥提高藥物吸收成為一種非常具有前景的策略。一個常規的途徑就是將PEPT1 識別基團（如氨基酸或者二肽）和母體藥物通過化學鍵連接在一起，使之成為能夠被PEPT1識別和轉運的前藥[26]。

3.1 二肽類前藥（Dipeptide-like prodrug）

擬二肽類前藥通常是在母藥的結構上接上1 個PEPT1 識別基團。多巴（L-dopa）是一種治療帕金森的藥物，但由于首過效應和低的小腸膜滲透率，口服生物利用度僅30%。Tamai 等[27]將L-dopa 的羧基與L-苯丙氨酸的氨基通過酰胺鍵相連，形成前藥L-dopa-L-Phe，Caco-2 細胞為模型研究發現，L-dopa-L-Phe 在PEPT1的介導下，膜滲透性是L-dopa 的40 倍。L-α-甲基多巴用于高血壓的治療，但α-甲基的存在嚴重降低了L-α-甲基多巴和PEPT1 的親和性，使得α-甲基多巴口服難吸收。Hu等[28]合成了前藥L-α-甲基多巴-L-苯丙氨酸。與其母藥相比，L-α-甲基多巴-L-苯丙氨酸在PEPT1 的介導下，小腸的膜滲透率比母藥提高了近20 倍。Wang 等[29]制備了L-α-甲基多巴的另一種二肽衍生物D-苯甘氨酸-L-α-甲基多巴。兔空腸在體單灌流實驗表明，前藥小腸滲透率是母藥的3.5 倍，而明顯小于L-苯甘氨酸-L-α-甲基多巴。

帕拉米韋是神經氨酸酶抑制劑，它的結構中含有胍基、羧基和羥基，使其小腸膜滲透性差，口服生物利用度約為5%左右。孫勇兵等[30]合成了系列帕拉米韋的氨基酸酯類前藥和酰胺類前藥，其中L-纈氨酸酯和L-異亮氨酸酰胺前藥都能大幅度提高帕拉米韋的口服生物利用度，利用高度表達PEPT1 的細胞系研究發現，L-纈氨酸酯和L-異亮氨酸酰胺前藥都是PEPT1 的底物，它們的膜滲透性分別是帕拉米韋的10.9 和9.1倍。孫勇兵等[31]開發的阿糖胞苷-L-纈氨酸酯鹽酸鹽能將阿糖胞苷的口服生物利用度由21.6%提高至60%，研究表明，阿糖胞苷-L-纈氨酸酯鹽酸鹽是PEPT1的底物，該前藥已經于2016年11月獲得了國家藥監局簽發的1.1類新藥的臨床研究批件。

地西他濱是一種用于治療骨髓增生異常綜合征等疾病DNA去甲基化抑制劑，但其膜滲透性差且在體內極易水解，生物利用度只有9%。Zhang 等[32]通過在地西他濱上引入不同氨基酸如色氨酸、異亮氨酸、酰胺酸等，合成了一系列以PEPT1 為底物的地西他濱氨基酸衍生化類前藥。其中L-苯丙氨酸酯前藥（5′-O-Lphenylanlany-dac）和L-纈氨酸酯前藥（5′-O-L-Vanlal-dac）的膜滲透性分別是地西他濱的3.75倍和3.28倍。大鼠藥物代謝動力學表示，L-苯丙氨酸酯和L-纈氨酸酯兩個前藥口服生物利用度分別提高了30%和20%。

3.2 三肽類前藥（Tripeptide-like prodrug）

一系列研究表明，將藥物設計成三肽，在PEPT1的介導下，可大大提高其口服生物利用度。在藥物分子中連上1 個二肽分子，即三肽類似物，使它成為PEPT1 底物。與二肽類似物相比，三肽類似物具有更高的結合親和力和穩定性[33]。Erza等[34]在帕米磷酸鈉（pamidronate）和阿侖磷酸鈉（alendronate）的分子結構上接上脯氨酰苯丙氨酸二肽，前藥的小腸吸收都比母藥提高了3 倍，Caco-2 細胞頂側到底側藥物轉運也有很大程度地提高。

阿昔洛韋常用于治療最初和復發的單純性黏膜皰疹，通常會引起角膜混亂，由于血眼屏障限制了親水性藥物進入眼內組織，因此可以優選具有高滲透性和優異酶穩定性的前藥。就阿昔洛韋而言，Gly-Val-ACV 比Val-ACV增加了約2倍的利用度，表明阿昔洛韋的二肽酯前藥比氨基酸酯前藥具有更高的全身利用度[35]。

奇多夫定是抗病毒藥物，為提高其穩定性，周潔等[36]對奇多夫定進行修飾，在其母藥上連接二肽，合成了一些列dipeptide-AZT 化合物，實驗結果表明它與頭孢氨芐之間存在著較強的競爭性抑制，證明二肽修飾AZT 化合物也是PEPT1 的底物之一，dipetide-AZT 化合物相比于AZT 具有不同的細胞內轉運效果以及細胞毒性。

當前，PEPT1 靶向前藥面臨的重要問題是前藥的化學和降解穩定性，很多前藥在被腸上皮細胞識別之前已經降解了[37]。這就是目前PEPT1 靶向藥物設計存在的主要挑戰[38]，主要原因是以PEPT1 為靶點的藥物設計，絕大多數是利用酯鍵將藥物和氨基酸相連，由于胃腸道中存在大量酯酶，前藥的酯鍵在胃腸道中是不穩定的。酯鍵的快速降解會導致前藥不能最大幅度地提高母藥的口服生物利用度，更嚴重的還會引起由前藥降解而生成的母藥在胃腸道局部聚集而導致的副作用。英國Idenix 公司開發的抗病毒藥物NM283（Valopicitabine）是2′-C-Methylcytidine 的纈氨酸酯，能夠在PEPT1 的介導下將母藥的生物利用度提高至34%[39]，但是在二期臨床研究中發現，當劑量提高至800 mg/d 時會引起嚴重的惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應，臨床研究被迫終止。研究發現，NM283 結構中酯鍵在腸道的不穩定性是生物利用度提高幅度較低（僅34%）和嚴重的胃腸副作用的主要原因[40]。美國密歇根大學的Smith DE 教授研究發現，雖然吉西他濱的L-纈氨酸前藥5′-L-valyl-gemcitabine 與PEPT1 的親和性很高，但是口服5′-L-valyl-gemcitabine后吉西他濱的生物利用度為10%，和口服吉西他濱是一樣，進一步的研究發現，是因為5′-L-valyl-gemcitabine在被小腸吸收之前已經完全降解了[41]。

因此，提高母藥與PEPT1 的親和性、前藥的胃腸道穩定性和前藥在體內的代謝激活之間必須取得平衡，也是目前以PEPT1 為靶點的前藥設計面臨的重要課題。

4 總結

PEPT1 在小腸上皮細胞刷狀緣側有豐富的表達，在一些營養物質和藥物的口服吸收中發揮著重要的介導作用，由于PEPT1廣泛的底物專屬性，PEPT1已經是通過前藥途徑提高難吸收藥物口服生物利用度的重要途徑。本文綜述了PEPT1 在組織和細胞中的表達和分布、三維晶體結構和在前藥設計中的應用。采用轉運蛋白靶向的前藥策略來改善母藥的藥動學性質，尤其是PEPT1 靶向的前藥，是一條快速有效的新藥創制手段。PEPT1在前藥設計中有效的解決了許多母藥存在著穩定性差、生物利用度不高、膜滲透差等問題，但如何避免前藥中酯鍵的快速降解會導致前藥不能最大幅度的提高母藥的口服生物利用度是目前仍需探索的問題。