錦燈籠配方顆粒UPLC指紋圖譜研究

唐雙燕，魏家保，趙偉志，鄭曉英，張輝，譚沛

（1.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518000；2.華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

錦燈籠為茄科植物酸漿Physalis alkekengiL.var.franchetii（Mast.）Makino 的干燥宿萼或帶果實的宿萼。秋季果實成熟、宿萼呈紅色或橙紅色時采收，干燥[1]。錦燈籠中的化學成分主要含有甾體、黃酮、氨基酸、生物堿及其他類型化合物[2-4]。其中甾體類、黃酮類為其主要成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[5-6]。甾體類化合物是近十年來在錦燈籠植物中發現最多的一類化學成分，主要包括酸漿苦味素類、新酸漿苦味素類和甾醇類化合物，其中以酸漿苦味素類居多且為其特征性化學成分；黃酮類化合物也是錦燈籠中發現比較多的成分之一，包括木犀草苷、木犀草素等[7]。

傳統湯劑存在服用、存儲、攜帶不便等問題。中藥配方顆粒和傳統湯劑相比具有質量穩定、療效可靠、服用方便、便于攜帶保管等優勢[8-10]。近年來，對錦燈籠的指紋圖譜研究也有報道[11-13]，但大多集中在錦燈籠藥材的質量控制研究方面，另有邢海燕等[14]僅對錦燈籠飲片標準湯劑特征圖譜進行研究，許亮等[15]建立了錦燈籠配方顆粒的木犀草素含量測定方法，均無針對錦燈籠配方顆粒的指紋圖譜研究，因此本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法建立錦燈籠配方顆粒的指紋圖譜，通過共有峰指認，分析不同產地的配方顆粒化學成分差異，從共同監控多種特征性成分的角度出發，建立錦燈籠配方顆粒指紋圖譜標準，為錦燈籠配方顆粒質量的整體評價提供思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀：Thermo Fisher Vanquish UPLC 色譜系統，配置四元泵、自動進樣器、色譜柱溫箱、二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 色譜管理系統；AB Sciex Triple TOF 4600 高分辨質譜儀和Analyst質譜數據處理軟件；ME36S百萬分之一天平（瑞士梅特勒）；XS204 十萬分之一天平（瑞士梅特勒）；SK5200H 超聲波儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑試藥

錦燈籠對照藥材（批號：DST181212-026）購于成都德斯特生物技術有限公司；對照品木犀草苷（批號：111720-202111，質量分數：96.6%）、木犀草素（批號：111520-202006，質量分數：94.4%）、酸漿苦味素L（批號：111831-201903）購于中國食品藥品檢定研究院；對照品酸漿苦味素A（批號：CFS202002，質量分數：98.0%）、4，7-二脫氫新酸漿苦素B（批號：CFS202102，質量分數：98.0%）購于Chemfaces 公司。乙腈為色譜純，水為超純水；磷酸、甲醇、乙酸乙酯等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品及制備方法

15 批錦燈籠藥材分別來源于遼寧省撫順、黑龍江省哈爾濱、吉林省遼源、陜西省西安、山西省臨汾。經安徽中醫藥大學劉守金教授鑒定為茄科植物酸漿P.alkekengiL. var.franchetii（Mast.）Makino的干燥宿萼或帶果實的宿萼。詳細信息見表1。

表1 樣品信息及編號Table 1 Sample information and number

錦燈籠配方顆粒制備方法：取錦燈籠飲片4 000 g，加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火煎煮30 min，200 目濾布過濾；藥渣再加6 倍量水煎煮25 min，合并2 次濾液，經70 ℃減壓濃縮至相對密度1.06～1.12 g/mL 的流浸膏，噴霧干燥（進風溫度：150～210 ℃，出風溫度：70～115 ℃），加麥芽糊精至1 000 g，混勻，制粒，即得錦燈籠配方顆粒（15 批飲片按此方法制備得到15 批次的配方顆粒，每1 g 顆粒相當于4 g飲片）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動相為乙腈（A）和0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，15%A→17%A；7～15 min，17%A→25%A；15～30 min，25%A→28%A；30～32 min，28%A→38%A；32～40 min，38%A→42%A），檢測波長220 nm，柱溫25 ℃，流速0.30 mL·min-1，進樣量為3 μL，理論板數按木犀草苷計算應不低于5 000。

2.2 參照物溶液的制備

稱取錦燈籠對照藥材1.021 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，加熱回流40 min，取出，濾過，用乙酸乙酯萃取兩次，每次25 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，放冷，殘渣加70%甲醇水溶液10 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續濾液作為對照藥材參照物溶液。另稱取木犀草苷4.013 mg、木犀草素4.022 mg、酸漿苦味素A 2.479 mg、酸漿苦味素L 2.577 mg、4，7-二脫氫新酸漿苦素B 2.396 mg，分別加甲醇定容于100 mL 的容量瓶中，作為對照品參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取錦燈籠配方顆粒0.4 g，加水10 mL 使溶解，用乙酸乙酯萃取兩次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘渣加70%甲醇水溶液10 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 精密度實驗 取同一份供試品溶液（批號：S1），連續進樣6次，記錄色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于2%。綜合判斷，方法的精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批樣品（批號：S1），制備6 份供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 結果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2%。綜合判斷，方法的重復性良好。

2.4.3 穩定性考察 取同一份供試品溶液（批號：S1），配制后在第0、4、8、12、16、24 h 進樣。記錄色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 特征峰指認 色譜條件：參照“2.1”項下，將“0.2%磷酸水溶液（B）”優化為“0.2%甲酸水溶液（B）”。質譜條件：采用電噴霧離子源，正、負離子監測模式；噴霧裂解電壓3.80 kV；輔助氣流量10 mL/min；毛細管溫度350 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；正負離子模式下的碰撞能均為10 eV，質量掃描范圍m/z50～1 700。MS/MS 模式時，正負離子模式下的碰撞能均為20 eV，質量掃描范圍m/z50～1 250。

參照上述色譜及質譜條件，分別吸取“2.2”項參照物溶液和“2.3”項供試品溶液，對15 批錦燈籠配方顆粒UPLC 指紋圖譜11 個共有色譜峰成分進行定性分析，以正、負離子模式掃描供試品，得供試品溶液的ESI-MS 總離子流，見圖1。結合文獻[16-19]報道和二級質譜裂解碎片的離子信息對特征峰進行識別，經對照品比對，確認色譜峰1 為木犀草苷，色譜峰3 為木犀草素，色譜峰4 為酸漿苦味素A，色譜峰6 為酸漿苦味素L，色譜峰10 為4，7-二脫氫新酸漿苦素B，定位結果見圖2。酸漿苦味素類化合物為酸漿屬植物的特征性化學成分，根據文獻[16-17，20]總結的裂解規律得出，該類化合物的質譜裂解特征主要為丟失CO、CO2、H2O，產生[M-H-H2O]－、[M-H-2H2O]－、[M-H-H2O-CO]－、[M-H-H2O-2CO2]－以及發生RDA 裂解和環的裂解而形成一系列特征離子峰。基于此，對其余特征峰的鑒定分析數據列于表2，為后續特征成分峰的定性提供參考依據。

圖1 錦燈籠配方顆粒總離子流圖Figure 1 Total ion current diagrams of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

圖2 錦燈籠配方顆粒對照品定位液相色譜圖Figure 2 Reference location chromatograms of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表2 錦燈籠配方顆粒成分分析結果Table 2 Results of composition analysis of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

2.5.2 指紋圖譜的建立 取“1.3”項下15 批錦燈籠藥材制備成錦燈籠配方顆粒，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，將實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，將各色譜峰匹配，建立對照指紋圖譜，15 批錦燈籠配方顆粒對照指紋圖譜具有11 個特征峰，共有特征峰峰面積之總和占總峰面積91.4%，表明選定的11 個特征峰可以作為錦燈籠鑒定的標志峰，見圖3。根據各峰響應及藥效方面所具的代表性，選擇以峰1（木犀草苷）參照峰相應的峰為S峰，計算特征峰2－11與S峰相對保留時間，相對保留時間應在規定值的±10%之內，規定值為：2.23（色譜峰2）、2.75（色譜峰3）、3.52（色譜峰4）、3.69（色譜峰5）、4.07（色譜峰6）、4.26（色譜峰7）、4.46（色譜峰8）、4.61（色譜峰9）、5.45（色譜峰10）、6.32（色譜峰11）。

圖3 15批錦燈籠配方顆粒共有模式圖譜Figure 3 Common pattern chromatograms of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

2.6 相似度評價

中藥指紋圖譜相似度可以評價各待測樣品與能表征中藥產品化學組分特征的標準圖譜之間的差異化。將15 批錦燈籠配方顆粒圖譜中各色譜峰匹配后，建立對照指紋圖譜，計算得到各批次與對照圖譜的相似度在0.984～1.000，相似度極高，結果表明了15批次樣品的化學成分較為類似，沒有明顯的差異。結果見表3－5。

表3 15批錦燈籠配方顆粒相對保留時間結果Table 3 Results of relative retention time of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表4 15批錦燈籠配方顆粒相對峰面積結果Table 4 Results of relative peak area of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表5 相似度結果Table 5 Similarity results

2.7 聚類分析評價

采用SPSS 22.0 軟件，以共有峰的峰面積為變量，采用組間聯接法、歐平方式距離對15 批錦燈籠配方顆粒進行聚類分析，結果如圖4 所示。根據聚類分析結果，歐式間距小于5 時，15 批錦燈籠配方顆粒樣品可以分為4類：第1類為S7、S8、S9，藥材產地為山西省臨汾市洪洞縣；第2 類為S1、S2、S3，藥材產地為陜西省西安市藍田縣；第3 類為S4、S10、S11，藥材產地為遼寧省撫順市清原滿族自治縣和黑龍江省哈爾濱市依蘭縣；第4 類為S5、S6、S12、S13、S14、S15，藥材產地為吉林省遼源市東豐縣和黑龍江省哈爾濱市依蘭縣。當歐式間距增大至15時，陜西省藍田縣和山西省洪洞縣樣品聚為一類，遼寧省清原滿族自治縣、黑龍江省依蘭縣和吉林省東豐縣樣品聚為一類，由聚類分析的結果可知，共有峰的峰面積與產地分布存在一定關聯，即藥材產地在地理位置上越接近，配方顆粒間的差異性越小。

圖4 系統聚類分析結果Figure 4 Results of systematic cluster analysis

2.8 主成分分析評價

采用SPSS 22.0 軟件，以11 個共有峰的峰面積為變量，進行主成分的分析，結果見表6。根據特征值大于1 和貢獻率達到85%以上作為提取原則，提取的主成分1 的特征值為6.438，貢獻率達到58.525%，提取的主成分2 的特征值為3.245，貢獻率達到29.497%，這兩個主成分的貢獻率達到了88.022%。對成分矩陣進行了具有Kaiser 標準化的正交旋轉，見圖5，得到11個指標（峰）在2個主成分旋轉成分矩陣。成分載荷矩陣的數值及符號代表變量在主成分當中的載荷，載荷越大，表明該化合物在主成分分析中作用越大。由表7結果可知，峰1對主成分1的影響力較大，其中峰1為木犀草苷。峰4對主成分2的影響力較大，峰4為酸漿苦味素A。以主成分1-X軸為例，主成分1主要信息來自距離原點最遠的峰1，而主成分2-Y 軸，距離原點最遠的為峰4。綜上結果，提示木犀草苷和酸漿苦味素A 適宜作為錦燈籠配方顆粒的質量標志物進行含量控制。

圖5 旋轉成分載荷圖Figure 5 Rotating component load diagram

表6 主成分的特征值和方差貢獻率Table 6 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表7 旋轉成分矩陣Table 7 Rotational component matrix

3 討論

本實驗對梯度洗脫條件、不同色譜柱［CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）、SB RRHD C18（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）、BEH Shield RP18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）、CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 150 mm，1.6 μm）］進行篩選及優化，CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）色譜柱下峰信息量最為豐富，對不同柱溫（23、25、27 ℃）、不同流速（0.28、0.30、0.32 mL·min-1）進行考察，流速為0.30 mL·min-1、柱溫為25 ℃時各特征峰分離最佳，并對不同儀器（Thermo Fisher Vanquish UPLC 和Agilent 1290Ⅱ）進行驗證，各特征峰較為一致且分離好，相對保留時間無偏差，同時采用二極管陣列檢測器（DAD）進行全波段檢測，發現在220 nm 處，色譜峰數較多且響應值較好。最終選擇色譜條件流動相乙腈-0.2% 磷酸水溶液，流速0.30 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長220 nm。

在供試品制備方法考察中對比了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇）、不同萃取溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、正丁醇）。三氯甲烷、乙醚因極性過低，導致萃取時特征峰缺失。水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇提取，乙酸乙酯、正丁醇萃取所得特征峰數量最多且基本一致，均呈現11 個特征峰，共有峰峰面積占總峰面積90%以上，能較好地代表錦燈籠配方顆粒整體質量，并指認了其中5個共有峰，分別為木犀草苷、木犀草素、酸漿苦味素A、酸漿苦味素L、4，7-二脫氫新酸漿苦素B。但經乙酸乙酯萃取富集后的圖譜基線平穩，特征峰更容易辨別和指認，因此最終確定了使用乙酸乙酯進行萃取，圖譜較為全面的展現了錦燈籠中的甾體類和黃酮類主要化學成分信息，可用于錦燈籠配方顆粒的質量監測。

綜上所述，通過建立錦燈籠配方顆粒UPLC 指紋圖譜，以相似度結合特征峰的相對保留時間，并使用聚類分析和主成分分析法對不同產地的樣品生產制得的配方顆粒質量進行分析，來自山西、陜西、黑龍江、遼寧、吉林5 個產地的錦燈籠藥材制備的配方顆粒都具有11 個特征峰，相似度均大于0.980，說明不同產地的錦燈籠成分組成基本一致。由聚類分析的結果可知，共有峰的峰面積與產地分布存在一定關聯，即藥材產地在地理位置上越接近，配方顆粒所含的成分越接近。主成分分析的結果表明對錦燈籠的質量控制研究可首要關注木犀草苷和酸漿苦味素A 的差異，二者可作為錦燈籠配方顆粒質量控制的質量標志物。本研究為錦燈籠配方顆粒的質量評價和質量控制提供了參考依據。