阿魏酸抑制p38 MAPK 信號傳導對巨噬細胞M1 極化的作用

韋子強，張雯雯，郭嘉亮，3，羅文匯，鄭兆廣，3，劉正，3，謝倩，曾煦欣，3

（1.佛山科學技術學院，廣東 佛山 528000；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市藥學會，廣東 佛山 528000）

急性肝損傷（Acute liver injury,ALI）常伴有炎癥反應的發(fā)生，過度且不可控的炎癥反應會導致肝細胞的損傷和凋亡，進一步加重肝臟損傷[1]。巨噬細胞作為一類具有異質性、可塑性的免疫細胞，通過吞噬外來微生物并遞呈抗原，分泌多種細胞因子參與炎癥反應，在ALI 發(fā)病機制中起著重要作用[2]。同時研究也顯示ALI 的加重與巨噬細胞極化為M1表型促進炎癥反應相關[3]，因此調控巨噬細胞極化抑制炎癥反應可作為治療ALI的重要切入點。阿魏酸（ferulic acid），化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，存在于當歸、川芎等中藥[4]。動物研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸具有良好的抗炎功效，并可以改善ALI[5-6]，但具體分子機制仍然缺乏相關研究。本文通過脂多糖（LPS）與干擾素-γ（IFN-γ）誘導巨噬細胞極化為M1表型，考察阿魏酸對其極化以及相關信號通路的影響，探討阿魏酸抗炎作用的分子機制，為開發(fā)預防肝損傷藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人單核細胞白血病THP-1 細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞中心；阿魏酸購自上海麥克林生化科技有限公司；RPMI1640 和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；佛波酯（PMA）、脂多糖（LPS）均購自碧云天公司；干擾素-γ（IFN-γ）購自北京索萊寶科技有限公司；熒光標記抗體CD80+（human,APC）購自Abcam 公司；Cell Counting Kit-8、Human IL-1βELISA Kit、Human TNF-αELISA Kit購自廣州真知生物科技有限公司；RNAprep pure培養(yǎng)細胞總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；SrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTMII 均購自Takara 公司；兔抗人p-38 抗體、兔抗人磷酸化p38（p-p38）、兔抗人GAPDH 抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 THP-1 細胞培養(yǎng)和巨噬細胞誘導 將單核細胞株THP-1 細胞接種在含10%（φ）胎牛血清、1%雙抗（青霉素及鏈霉素）的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。培養(yǎng)狀態(tài)良好的3～5 代用于實驗。THP-1 細胞用10 ng/mL PMA 經(jīng)過24 h 誘導成M0 型巨噬細胞，更換新的培養(yǎng)基，加入10 ng/mL LPS 與20 ng/mL IFN-γ處理細胞48 h，使M0型向M1型巨噬細胞方向極化。

1.2.2 CCK-8測定細胞活性 在96孔板中每孔加入THP-1 細胞（1×104/mL）100 μL 的細胞懸液。對THP-1 細胞誘導成M0 型巨噬細胞后，再進行M1 型極化誘導48 h，同時每組加入阿魏酸20、40、60、80、100 μmol/L。按照CCK-8 試劑盒說明書進行檢測，用酶標儀測定450 nm處吸光度值（A值）。根據(jù)結果計算各組的細胞活性，確定阿魏酸對M1型巨噬細胞的安全濃度范圍。細胞活性（viability）=加藥培養(yǎng)組（A值）/空白對照組（A值）×100%，實驗獨立重復3次。

1.2.3 流式細胞分析儀檢測M1 型巨噬細胞標志物 經(jīng)過CCK-8 法測定阿魏酸對M1 型巨噬細胞的安全濃度范圍后，在6 孔板中每孔加入THP-1細胞（2×106/mL）1 mL 的細胞懸液，誘導成M0 型巨噬細胞后，再進行M1 型極化誘導48 h，同時每組加入阿魏酸20、40、60、80 μmol/L。通過胰酶消化后，1 000 r/min 離心5 min 收集細胞，PBS 清洗3 次，用1%BSA進行封閉1 h去除非特異性結合，在M1型巨噬細胞加入CD80+熒光抗體進行4 ℃孵育30 min，結束后PBS洗滌3次，加入PBS重懸，使用流式細胞分析儀對M1型巨噬細胞標志物進行檢測，實驗獨立重復3次。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測TNF-α、IL-1β蛋白含量 收集上述各組M1 型巨噬細胞的上清液，檢測M1型巨噬細胞分泌蛋白TNF-α、IL-1β的表達。其具體步驟按ELISA 試劑盒說明書進行操作，450 nm 下測定各組A 值，計算相關蛋白表達量，實驗獨立重復3次。

1.2.5 實時熒光定量PCR 法檢測mRNA 的表達水平 在6 孔板中每孔加入THP-1 細胞（1×107/mL）1 mL 的細胞懸液，誘導成M0 型巨噬細胞，再進行M1 型極化誘導48 h，同時每組加入阿魏酸20、40、60、80 μmol/L。通過胰酶消化后，1 000 r/min 離心5 min 收集細胞，冰冷PBS 洗滌。具體步驟按總RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒和Real Time PCR試劑盒說明書進行操作，RT 條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；PCR 反應條件：預變性：95℃，30 s；PCR反應：40個循環(huán)，95℃，5 s，60 ℃，30 s。引物見表1。以GAPDH 內參基因校正，對特異性擴增目標基因進行相對定量，采用2-ΔΔCt法[7]計算各組細胞的TNFα、IL-1βmRNA表達水平，實驗獨立重復3次。

表1 Real Time PCR引物序列Table 1 Real time PCR primer sequences

1.2.6 Western blot 法檢測p-38和p-p38的表達

實驗分組及處理同“1.2.5”項下操作，從各細胞組中提取細胞漿蛋白，通過BCA法測蛋白濃度。各取5 μg蛋白上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過轉膜將蛋白轉移到PVDF 膜上，封閉2 h，分別加入適宜濃度的p38 MAPK、p-p38 MAPK 和GAPDH抗體，4 ℃搖床孵育過夜。使用TBST 洗膜后，用二抗進行孵育，再次洗膜后加入ECL 化學發(fā)光試劑在Odyssey FC 儀器上進行檢測顯色條帶，以GAPDH為內參。結果應用Image one軟件進行總灰度分析，計算p38 MAPK、p-p38 MAPK 的相對表達量，實驗獨立重復3次。

1.2.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間差異比較采用t檢驗；多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 阿魏酸對M1型巨噬細胞活性的影響

結果如圖1 所示，與對照組相比，M1 型巨噬細胞在阿魏酸濃度20 ～80 μmol/L 的細胞活性均無顯著性差異（P＞0.05），當阿魏酸濃度為100 μmol/L時，細胞活性明顯下降（P＜0.05）。因此選擇阿魏酸濃度為20～80 μmol/L進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度阿魏酸對M1型巨噬細胞活性影響Figure 1 Effect of different concentrations of ferulic acid on the activity of M1 type macrophages

2.2 阿魏酸對M1型巨噬細胞表面標志物的影響

流式細胞儀檢測結果如圖2所示。隨著阿魏酸濃度的增加，M1型巨噬細胞標志物CD80+的表達顯著降低（P＜0.05），說明阿魏酸抑制M0 型巨噬細胞向M1型極化。

圖2 阿魏酸對M1型巨噬細胞標志物CD80+表達的影響Figure 2 Effect of ferulic acid on the expression of M1 type macrophages marker CD80+

2.3 阿魏酸對M1型巨噬細胞分泌蛋白的影響

ELISA 和Real-time PCR 實驗結果如圖3 所示，與對照組相比，20～80 μmol/L 的阿魏酸能抑制M1型巨噬細胞TNF-α、IL-1β蛋白和mRNA 的表達（P＜0.05），上述作用呈劑量依賴性。說明阿魏酸抑制M0 型巨噬細胞向M1 型極化，進而減少M1 型巨噬細胞分泌產(chǎn)物。

圖3 阿魏酸對M1型巨噬細胞TNF-α、IL-1β蛋白和mRNA表達的影響Figure 3 Effect of ferulic acid on the expression of TNF-α,IL-1β protein and mRNA in M1 type macrophages

2.4 阿魏酸對M1 型巨噬細胞p38 MAPK 信號通路的影響

Western blot 實驗結果如圖4 所示，與對照組相比，p-p38/p38 MAPK蛋白表達比例隨著阿魏酸濃度升高而降低（P＜0.05）。說明阿魏酸能夠顯著抑制p38 MAPK信號通路活化。

圖4 阿魏酸對M1型巨噬細胞p38 MAPK信號通路蛋白表達的影響Figure 4 Effect of ferulic acid on the protein expression of p38 MAPK signaling pathway in M1 type macrophages

3 討論

ALI 可由不同誘因造成的肝臟急性炎癥性疾病[8]。炎癥反應在ALI 治療進展中有著重要作用，因此調控炎癥反應治療ALI 成為研究熱點[9]。巨噬細胞作為一類具有異質性、可塑性的免疫細胞，可分為2 個極化表型：促炎的M1 型和抗炎的M2型[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，在ALI 大鼠模型中M1 型和M2型巨噬細胞共同參與了肝損傷進程，并在病變進展過程中相互轉化[12]，M1 型巨噬細胞促進炎癥反應，使ALI加重[3]。表明巨噬細胞極化與ALI密切相關。

近年研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以顯著降低LPS誘導巨噬細胞分泌產(chǎn)物[13-14]。本研究結果表明，阿魏酸通過減少M1型巨噬細胞標志物CD80+的表達，抑制了M0型巨噬細胞向M1型極化，同時降低M1型巨噬細胞TNF-α和IL-1β分泌產(chǎn)物的蛋白和mRNA 表達水平。由此說明阿魏酸通過抑制巨噬細胞向M1 型極化，減少TNF-α等炎癥因子的釋放，最終產(chǎn)生抗炎作用。

為了深入研究阿魏酸抑制M1 型巨噬細胞極化的具體分子機制，本研究進一步考察阿魏酸p38 MAPK 信號通路對M1 型極化的影響。p38 MAPK信號通路廣泛參與巨噬細胞活動，包括增殖、分化和免疫反應[15]，同時是調控巨噬細胞極化的主要通路。謝娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)PICK1 可以促進p38 MAPK信號通路，使巨噬細胞向M2 型極化，增加Arg-1 和IL-10 等抗炎因子的釋放，進而改善急性肝損傷疾病。肖芳等[17]表示纖維介素蛋白2（FGL2）可以抑制p38 MAPK蛋白磷酸化水平，促進M1型巨噬細胞極化，增加IL-6、TNF、IL-1β等炎癥因子表達，從而減輕肝臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可下調M1 型巨噬細胞的p-p38/p38 MAPK 蛋白表達比例，表明阿魏酸影響巨噬細胞M1 極化的機制是抑制p38 MAPK信號通路活化。文獻顯示核轉錄因子（Nrf2）參與調節(jié)p38 MAPK 信號通路[18]，二烯丙基二硫和雷公藤酚都可以通過激活Nrf2 抑制p38 MAPK 信號通路，進而抑制M1 型巨噬細胞極化，減少炎癥因子的分泌[19-20]。由此提示在后續(xù)研究中可通過考察阿魏酸對巨噬細胞極化過程中Nrf2 核轉錄因子的作用，進一步挖掘深化其抗炎分子機制。

綜上所述，本研究提示阿魏酸可能通過抑制p38 MAPK 信號通路實現(xiàn)對巨噬細胞極化的調控，發(fā)揮抗炎作用，進而改善ALI。此外，M2 型巨噬細胞可分泌抗炎因子進行組織修復，理論上有助于減輕ALI[3]。因此，本研究后續(xù)除繼續(xù)深入探討阿魏酸調控M1 型巨噬細胞極化的分子機制外，還將考察阿魏酸對M2 型巨噬細胞極化的作用機制，為ALI的藥物研發(fā)提供更多參考依據(jù)。