牛至油不同復配組合的體外聯合抗菌作用及機理研究

古卓強，梁文輝

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

細菌感染性疾病是呼吸系統[1]、消化系統[2]及泌尿系統[3]的臨床多發病，主要致病菌分為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-），如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等[4]。在臨床上，首選β-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類等抗生素藥物進行治療[5]，雖然能夠有效殺滅和抑制病原菌，但隨著亂用、濫用問題的嚴重化，導致細菌耐藥率越來越高，多重耐藥菌、泛耐藥菌問題日益突出，已嚴重地威脅人類的生命健康。據2021年1～12月國內51所醫院臨床分離菌301 917株的耐藥監測結果顯示，其中革蘭陽性菌占28.6 %，革蘭陰性菌占71.4%[6]；在對中國2019－2020革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的耐藥監測研究報告中顯示[7-8]，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等為臨床上易產生耐藥的主要致病菌。

中藥揮發油是從植物中提取分離得到的具有揮發性的油狀液體，是芳香類中藥最具代表性的有效組分，含有萜類、酚類、醇類、醛類、酮類等不同類型化合物，抗菌譜廣、抗菌作用強[9]，如桉葉精油[10]、百里香油[11]、肉豆蔻油[12]、香茅油[13]、肉桂油[14]等對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見的致病菌均具有顯著抑菌作用。因此，在新型抗生素研發的過程中，從中藥揮發油中尋找和開發抗菌先導化合物具有重要的實際意義，可快速為臨床治療感染性疾病地提供新的藥物方案。

牛至油是從唇形科牛至屬的芳香草本植物牛至全草中提取得到的淡黃色透明液體，含有香芹酚、百里香酚、丁香酚、α-蒎烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、芳樟醇、α-松油醇等不同類型成分[15]，對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、葡萄牙念珠菌等致病菌具有優良的抗菌作用[16-17]。本研究選用牛至油為核心藥物，開展與肉桂油等其他中藥揮發油的復配組合篩選，初步研究其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗菌活性及作用機理，為臨床治療細菌感染性疾病提供更多思路和方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 標準菌株：金黃色葡萄球菌（S.aureus,ATCC 6538），大腸桿菌（E.coli,ATCC 25922），廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.1.2 藥品 牛至油（20221102）、丁香油（20221009）、艾葉油（20221206）、香薷油（20221025）、薄荷油（20221118）、菊花油（20221025）、荊芥油（20221220）、姜黃油（20230101）、肉桂油（20221015）、藿香油（20221028）、青蒿油（20221206）、金銀花油（20221206）、蒲公英油（20221020）、山蒼子油（20221118）、小茴香油（20221124）、石菖蒲油（20221220），質量分數均為100%，江西泰誠天然香料有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 TSA 培養基、TSB 培養基、0.5%TTC 溶液，青島海博生物技術有限公司；BCA試劑盒（20221208）、堿性磷酸酶試劑盒（20221103），江蘇寶萊（酶免）生物科技有限公司；Multiskan?FC 酶標儀（ThermoFisher公司）；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；PH-050A 恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；LX-280D 型壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 助溶劑配制 吸取2 mL 吐溫-80、5 mL DMSO溶液，加入無菌水定容至100 mL，超聲15 min，即得助溶劑溶液。

作為一個工程設計人員，絕大多數的工作時間都是在和圖紙與規范打交道，在和同事的溝通中也是以交流技術問題為主。而對于技術問題，絕大多數都是有一個絕對正確的答案的。在溝通中，決定說服與被說服的，其實很簡單，就是看你掌握的相關知識是否豐富。加之自己比較內向的性格，可想而知，我的溝通能力是比較差的，單純的動之以情、曉之以理的技巧性說服，在平時的工作和生活中并不多。

1.2.3 菌液培養 將S.aureus、E.coli標準菌株復蘇，接種于液體培養基中，37 ℃培養20 h，以麥氏比濁管作為比對，用無菌生理鹽水稀釋成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液。

1.2.4 抑菌圈直徑測定[18]在瓊脂培養基上加入100 μL菌懸液，涂勻，將無菌空白藥敏片貼放于瓊脂板上，吸取10 μL中藥揮發油加于空白藥敏片上，37 ℃培養20 h后，測量抑菌圈直徑大小，實驗平行3份。判斷標準：＞20 mm為極敏感，15～20 mm為高度敏感，10～15為中度敏感，6～10mm為低度敏感。

2.3.2 牛至油及復配組合對核酸、蛋白質的影響

教學目標的確定是教學活動的首要工作，是實施教學的主導環節。學習目標一方面是學生學習過程中前進的目標，另一方面是教師組織課堂教學內容的基礎，是評價學生學習效果的標準。在BOPPPS模型中強調教學目標必須是具體的、明確的描述，包括誰是教學對象、要學什么、在什么情況下學、如何學，從而使教學目標更具可操作性。

1.2.6 FICI指數測定[19]分別選擇對S.aureus、E.coli抑菌作用強的中藥揮發油與牛至油進行復配組合，采用棋盤稀釋法，在48 孔板中，第1 橫排第1～4 孔中加入200 μL菌液；并根據“1.2.5”項下的MIC測定結果，再加入合適濃度的牛至油和其他中藥揮發油各100 μL，使得第1～4孔中牛至油濃度均為1/2 MIC，其他中藥揮發油濃度分別為1/2、1/4、1/8、1/16 MIC；同理操作，使得第2～4 橫排1～4 孔中牛至油濃度分別為1/4、1/8、1/16 MIC，其他中藥揮發油濃度分別為1/2、1/4、1/8、1/16 MIC；實驗平行3份；置于37 ℃培養箱培養20 h，每孔再加入0.5%TTC溶液10 μL，37 ℃培養1 h，如無顏色變化者即為聯合MIC；按照下式計算不同復配組合的FICI指數。

1.2.2 藥液配制 分別吸取牛至油和其他中藥揮發油各100 μL 至EP 管中，加入900 μL 助溶劑，震蕩混勻，配制成100.0 μL/mL 的乳濁液，再用助溶劑按二倍稀釋法稀釋成50.0、25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 μL/mL。

FICI=MICA聯合/MICA單用+MICB聯合/MICB單用

牛至油、丁香油、艾葉油等16 種中藥揮發油對S.aureus的抑菌圈直徑為6.5～43.8 mm、MIC 為0.20～50.0 μL/mL，以牛至油、山蒼子油最佳，而艾葉油、小茴香油則最差。對E.coli的抑菌圈直徑為6.2～26.5 mm、MIC 為0.78～＞50.0 μL/mL，以牛至油、肉桂油最佳，而姜黃油、藿香油最差。與其他中藥揮發油相比，牛至油對S.aureus、E.coli均表現出優良的抗菌作用。見表1。

1.2.7 細胞內容物外滲量測定[20]分別吸取一定濃度的牛至油、丁香油、牛至油-丁香油復配油各1 mL于5 mL 試管中，再加入菌液1 mL，混勻后使得藥物終濃度為MIC，以無菌生理鹽水作為空白對照，實驗平行3 份；置于37 ℃培養箱培養6 h，取出后在5 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液，（1）根據AKP 試劑盒操作說明進行AKP 活性測定；（2）采用酶標儀測定上清液的A260值，計算DNA、RNA 等核酸物質外泄量水平；（3）根據BCA 試劑盒操作說明測定A562，計算蛋白質外泄量。

1.2.8 細胞膜電位測定[17]分別吸取一定濃度的牛至油、丁香油、牛至油-丁香油復配油各1 mL 于5 mL試管中，再加入菌液1 mL，混勻后使得藥物終濃度為MIC，以無菌生理鹽水作為空白對照，實驗平行3份；置于37 ℃培養箱培養6 h，取出后在5 000 r/min低溫離心15 min，取菌體沉淀物，以PBS 溶液沖洗2～3 次，再加入2 μg/mL 的羅丹明123 溶液，靜置避光0.5 h，用PBS 溶液沖洗2～3 次，在激發波長480 nm、發射波長530 nm 的條件下，用熒光分光光度計測定熒光強度。

2.3.1 牛至油及復配組合對AKP 活性的影響 通過測定結果可知，與空白菌（AKP 活性0.072 8 U/L）相比，以MIC 濃度的牛至油（0.20 μL/mL）、肉桂油（0.39 μL/mL）及牛至油（0.125 μL/mL）-肉桂油（0.125 μL/mL）復配組合作用6 h，對S.aureus、E.coli的AKP 活性分別為0.363 0、0.371 7、0.416 0 U/L 和0.362 7、0.391 3、0.463 3 U/L，均能夠顯著提高細胞外AKP 含量（P＜0.05）；同時，牛至油-肉桂油復配組合與單方牛至油、肉桂油相比，對S.aureus、E.coli細胞壁的破壞作用相當，胞外AKP 含量差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖1。

1.3 統計學方法

抑菌圈直徑以均值±標準差表示，其他實驗數據以均值表示，采用SPSS 20.0 軟件進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

隨著經濟高速發展，綜合國力的不斷增強，旅游者的消費觀念也在發生著變化。參加霍童古鎮旅游的人群主要是個體戶、學生和企事業單位人員，他們都有著一定的教育背景，對旅游也有一定的理解，對于古鎮獨特的民俗資源和清新的自然環境充滿向往。政府在開發霍童古鎮旅游時應從大局出發，統籌規劃，建立相關指導性文件，加強對霍童古鎮旅游的宣傳力度，根據霍童旅游產品的特點，利用傳統和現代相結合的促銷手段進行促銷，打造具有地方特色的古鎮旅游產品。

牛至油與山蒼子油、肉桂油、石菖蒲油、丁香油、金銀花油進行復配組合，測得對S.aureus的FICI 指數為0.25～0.75，其中牛至油與肉桂油、山蒼子油、石菖蒲油、丁香油復配表現出協同作用，以牛至油（0.125 μL/mL）-肉桂油（0.125 μL/mL）為最佳；與金銀花油表現為相加作用。

2 結果

2.1 體外抑菌活性

其中，FICI≤0.5 時，為協同作用；0.5＜FICI≤1時，為相加作用；1＜FICI≤2 時，為無關作用；FICI＞2時，為拮抗作用。

舉報信中稱，張譯多次向吳湞反映其下屬尹紅章的問題。2006年，尹紅章任國家藥監局藥品注冊司生物制品處處長時，將張所在企業依生藥業已獲得審評中心認可進入臨床試驗的世界領先的創新藥品違法退回審評中心；2010年，尹紅章調任藥品審評中心副主任，“利用手中權力主導了此藥品之后的審評工作，使本應進入臨床試驗的創新藥品再次沒能通過審評”。

表1 不同中藥揮發油對S.aureus和E.coli的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of volatile oils from different Chinese medicines against S.aureus and E.coli(n=3)

2.2 聯合抑菌指數（FICI）

我支教結束離開小學的時候，特意去書店買了幾本書，然后送給了他，每本書上我都寫了一些話，我并不能給他多少物質幫助，我只能盡力給他一些希望和勇氣。

牛至油與肉桂油、石菖蒲油、丁香油、艾葉油、香薷油進行復配組合，測得對E.coli的FICI 指數為0.375～＞1.0，其中牛至油（0.125 μL/mL）-肉桂（0.25 μL/mL）油復配表現出協同作用，與石菖蒲油、丁香油表現為相加作用，與艾葉油、香薷油則表現為無關作用。見表2。

表2 牛至油不同復配組合的FICI指數Table 2 FICI index of different combinations of origanum oil(n=3)

2.3 抗菌作用機制

最早是韓國整形美容行業始于20世紀50年代，期初是為了給先天畸形或者給在戰爭中受傷的殘疾者進行治療，到了70年代才有了現代意義上的整容也。整容在國內流行大概是從20世紀90年代初開始，最開始是因臉部燒傷而整容的人居多，到1998年以后整容成為潮流。現在每天每個醫院里每個可以做五六臺整容的，人群主要是二三十歲的女性，男性逐漸增多。隨著社會經濟的不斷發展，從燒傷整形科衍生出來的整形醫學不再滿足于“雪中送炭”的傳統角色，開始順應社會的需求做更多“錦上添花”的事。越來越多的人通過整容來達到變美的目的。

圖1 牛至油及復配組合對S.aureus、E.coli胞外AKP含量的影響Figure 1 Effect of origanum oil and its combination on extracellular AKP content of S.aureus and E.coli(n=3)

1.2.5 MIC測定[18]在96孔板上，橫排第1～12孔中加入菌液100 μL，第1～11 孔中各加入系列藥液100 μL，第12孔加入助溶劑溶液，實驗平行3份；置于37 ℃培養箱培養20 h，每孔再加入0.5%TTC 溶液10 μL，37 ℃培養1 h，如無顏色變化者即為MIC。

與S.aureus、E.coli空白菌相比（A260為0.114 0、0.117 8），以MIC濃度的牛至油、肉桂油、牛至油-肉桂油復配組合作用6 h，S.aureus、E.coli上清液的A260值分別為0.370 6、0.360 2、0.454 1 和0.389 1、0.401 6、0.471 4，均顯著增加（P＜0.05）；同時，牛至油-肉桂油復配組合與單方牛至油、肉桂油相比，對S.aureus、E.coli細胞膜的破壞作用接近，胞外DNA、RNA 等核酸物質含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 牛至油及復配組合對S.aureus、E.coli 胞外DNA、RNA含量的影響Figure 2 Effect of origanum oil and its combination on extracellular content of DNA and RNA of S. aureus and E.coli(n=3)

與S.aureus、E.coli空白菌相比（蛋白質含量為0.107 3、0.120 6 mg/mL），以MIC 濃度的牛至油、肉桂油、牛至油-肉桂油復配組合作用6 h，S.aureus、E.coli的胞外蛋白質含量分別為0.477 3、0.454 5、0.530 5 mg/mL 和0.485 8、0.467 3、0.520 3 mg/mL，均顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時，牛至油-肉桂油復配組合與單方牛至油、肉桂油相比，對S.aureus、E.coli外泄蛋白質的含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 牛至油及復配組合對S.aureus、E.coli胞外蛋白質含量的影響Figure 3 Effect of origanum oil and its combination on extracellular protein content of S.aureus and E.coli(n=3)

2.3.3 牛至油及復配組合對細胞膜電位的影響

與S.aureus、E.coli空白菌相比（熒光強度為467.55、529.29 AU），以MIC 濃度的牛至油、肉桂油、牛至油-肉桂油復配組合作用6 h，S.aureus、E.coli的熒光強度分別下降至80.44、81.49、73.49 AU 和93.12、91.60、77.78 AU，均顯著地降低（P＜0.05）；同時，牛至油-肉桂油復配組合與單方牛至油、肉桂油相比，對S.aureus、E.coli膜電位強度差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 牛至油及復配組合對S.aureus、E.coli細胞膜電位的影響Figure 4 Effects of origanum oil and its combination on cell membrane potential of S.aureus and E.coli(n=3)

3 討論

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的代表性菌株，是開展藥物抗菌作用研究的常用對象。本研究測定牛至油、丁香油、艾葉油等16 種中藥揮發油對S.aureus、E.coli的抑菌圈直徑和MIC，結果顯示，這些中藥揮發油均有一定的抗菌作用；其中牛至油的抑菌作用最強（43.8、26.5 mm，0.20、0.78 μL/mL），其次為肉桂油（32.6、24.0 mm，0.39、0.78 μL/mL），而且牛至油-肉桂油復配組合在1∶1（0.125 μL/mL∶0.125 μL/mL）1∶2（0.125 μL/mL∶0.25 μL/mL）比例下，能夠起到顯著的協同抗菌作用。可能是牛至油與肉桂油中的某些成分能夠相互作用，從而提高抗菌性能，如香芹酚、百里香酚、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛，下一步工作重點將對復配組合前后的成分變化展開系統研究。

在作用機理方面，揮發油及其成分的主要抗菌作用機理與破壞細胞質膜結構蛋白、膜通透性，抑制ATP 合成以及影響脂質層穩定與菌體群體感應活性等有關[9]。本研究發現，單方牛至油、單方肉桂油、牛至油-肉桂油復配組合均能夠有效破壞細菌細胞壁和細胞膜結構的完整性，提高膜的通透性，使得胞內遺傳物質DNA、RNA 等核酸外泄，從而引起菌體凋謝死亡；相比之下，牛至油-肉桂油復配組合能夠在更低濃度下發揮更強的破壞作用，這可能與不同成分的多途徑作用有關，使得細胞的保護屏障被破壞得更快，需繼續深入研究以闡明其作用機制。

排除標準：研究中未表明受試者并發癥、臨床診斷不明或未對髖臼骨缺損進行Paprosky分型；文獻中數據不足，導致無法提取數據；薈萃分析、系統分析、病例報道及動物實驗；重復試驗或不完全的研究。

我又繼續說：“我剛才的確有點著急，沒有顧及你的感受。記得我讀四年級的時候，一次自習課上，我無意識地按動手里的圓珠筆，發出了‘吧嗒吧嗒’聲，數學老師當著全班同學的面吼了我，我當時覺得又生氣又丟臉……”

我國的芳香植物資源豐富，中藥揮發油及其活性抗菌成分均是現代新型綠色抗生素開發的潛在物質，可作為有效的天然抗菌劑應用于臨床治療由革蘭陽性菌、革蘭陰性菌引發的感染性疾病，具有作用強、抗菌譜廣、無藥物殘留、毒副作用小、不易產生耐藥性等優勢。雖然具有良好的開發前景，但中藥揮發油的成分復雜多樣，需要闡明其有效物質基礎和作用機制，這是臨床應用的關鍵。另外，單方揮發油的作用可能弱于復方揮發油，因此需要對不同復配組合展開研究，尋求更多抗菌效果優良的組合。