HPLC-MS/MS法測定人血漿丙戊酸濃度的不確定度評定

戴麗靜，楊燁，劉威楊，孫秀佳，溫領華，溫預關

（1.廣州醫科大學附屬腦科醫院，廣東 廣州 510370；2.廣州醫大新藥創制有限公司，廣東 廣州 510700；3.上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心/上海市重性精神病重點實驗室，上海 200032）

丙戊酸（valproate,VPA）是一種八碳分鏈羧酸，在中樞神經系統中可增加γ氨基丁酸（γ-aminobu‐tyric acid, GABA）水平，抑制GABA 轉氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶，并阻斷鈉、鉀和鈣通道等電壓門控離子通道，最初用于治療癲癇和偏頭痛，在精神病學中VPA 作為情緒穩定劑用于治療雙相情感障礙[1]。VPA 在臨床上治療窗窄，個體差異大，血藥濃度監測對VPA 的臨床應用具有重要意義。2017年，歐洲神經精神藥理學與藥物精神病學協會（Arbeitsgemeinschaft für Neuropsychopharmakologie und Pharmakopsychiatrie,AGNP）發布的治療藥物監測（Therapeutic Drug Monitoring,TDM）指南將丙戊酸TDM 作為一級推薦[2]。目前，關于測定人血中丙戊酸的方法主要有HPLC 法[3]、HPLC-MS/MS 法[4]、二維液相色譜（2D-LC）法[5]等，其中HPLC-MS/MS法專屬性強，靈敏度高，可實現快速、準確分析，被廣泛應用。中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assess‐ment, CNAS）17025、15189 認證體系明確提出檢測方法的不確定度評估要求。不確定度指表征合理地賦予被測量值的分散性，表示由于測量誤差的存在而對被測量值不確定的程度，是反映測量結果數據準確性和可靠性的指標[6]。

目前，報道測定人血漿中丙戊酸濃度的不確定度評定方法的文獻較少。本研究建立一種簡便快速的HPLC-MS/MS 法用于丙戊酸的血藥濃度監測和藥動學研究，從而指導臨床用藥，并根據不確定度相關指南規范[7-8]，參考文獻[9-11]分析HPLC-MS/MS 法測定人血漿中丙戊酸濃度的不確定度以及對測定結果的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260II-G6470A 液質聯用儀（Agilent,USA）；Arium comfort 超純水儀（Sartorius,Germany）；QUINTIX65-1CN 電子天平（Sartorius, Germany）；VORTEX 3 漩渦混合器（德國IKA 公司）；Allegra X-15R 離心機（Backman coulter, USA）；Microfuge 16 離心機（Backman coulter, USA）；10、20、50、100、200 μL和1 mL移液器（Thermo Fisher,USA）。

1.2 試藥

丙戊酸鈉（C8H15NaO2，批號：100963-202205，質量分數：99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；丙戊酸-d4（C8H12D4O2，批號：V-125，質量分數99.6%，CDN isotopes）；丙戊酸鈉緩釋片（商品名：Depakine Chrono?，規格：500 mg/片，批號：CA756A，Sanofi Aventis France）；色譜級乙腈、甲醇、異丙醇（Thermo Fisher，USA）；LC-MS 級乙酸（上海麥克林生化科技公司）。

2 方法

2.1 測定條件

色譜條件：Agilent 1260II 高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動相為含0.02%乙酸的水溶液（A）-含0.02%乙酸的甲醇溶液（B）、梯度洗脫（0～1.00 min，10%B；1.01～4.00 min，60%B；4.01～5.10 min，95%B；5.11～7.00 min，10%B），流速為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為4 μL。

質譜條件：Agilent G6470A 三重四級桿質譜儀，負離子掃描，MRM 檢測模式，ESI電離，干燥氣溫度為250 ℃，干燥氣流量為11 L/min，鞘氣溫度為300 ℃，鞘氣流量為11 L/min，掃描時間為250 ms，定性定量離子對為丙戊酸鈉143.0→143.0、丙戊酸-d4147→147。

2.2 溶液制備

2.2.1 丙戊酸儲備液與工作液的制備 精密稱定2 份丙戊酸鈉50.0 mg 于量瓶中，加入甲醇溶液溶解，配得質量濃度為10 mg/mL 的儲備液A、B，超聲混勻。吸取儲備液A 適量，用甲醇定量稀釋成質量濃度分別為8、16、40、100、400、800、1 600、2 000 μg/mL的系列標準曲線工作液。吸取儲備液B 適量，用甲醇定量稀釋成質量濃度分別為8、24、240、1 500、8 000 μg/mL 的定量下限（lower limit of quantitation,LLOQ）、低質控濃度（low quality control concentration,LQC）、中質控濃度（medium quality control concentration,MQC）、高質控濃度（high quality control concentration,HQC）、稀釋質控濃度（diluted quality controlconcentration,DQC）工作液。

2.2.2 內標儲備液與工作液的制備 取適量丙戊酸-d4，用甲醇配得最終質量濃度約為1 000 μg/mL 的儲備液，超聲混勻。取適量儲備液，用甲醇定量稀釋成500 ng/mL的內標工作液。

2.2.3 標準曲線樣品與質控樣品的配制 精密吸取人空白混合血漿190 μL 于2.0 mL EP 管中，加入系列標準曲線工作液10.0 μL，渦旋混勻30 s，配制成質量濃度分別為0.4、0.8、2、5、20、40、80、100 μg/mL的標準曲線樣品。標準曲線樣品在每個分析批中新鮮配制。

精密吸取人空白混合血漿475 μL 于2.0 mL EP管中，加入系列質控工作液25 μL，渦旋混勻30 s，配制成質量濃度分別為0.4、1.2、12、75、400 μg/mL 的質控樣品。

2.2.4 血漿樣品預處理 采用甲醇蛋白沉淀法進行血漿樣品預處理，將樣品渦旋震蕩10 s，轉移100 μL 至1.5 mL EP 管內，加入內標工作液400 μL，1 500 r/min條件振搖5 min充分混勻后，在3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液150 μL進樣。

2.2.5 色譜圖采集與濃度計算 采用內標法進行定量計算，以丙戊酸與內標的色譜峰面積比為縱坐標，采用加權（W=1/x2）最小二乘法，以血漿中丙戊酸濃度（x）與峰面積比（y）進行線性回歸，標準曲線方程為y=ax+b，其中a為斜率，b為截距。

2.2.6 不確定度來源 A 類評定為重復性測量，B 類評定為對照品稱量、對照品純度、溶液配制、含藥血漿配制、提取回收率、基質效應、標準曲線擬合和儀器測定。

3 結果

3.1 測量重復性（A類評定）

配制低、中、高質量濃度的LQC、MQC、HQC 質控樣品溶液3 批，每批平行配制6 份（m=3，n=6），測量結果見表1。

表1 樣品重復測量結果Table 1 The results of determination of Repeatability（n=6）

根據貝塞爾公式計算得出合并樣本標準差：

式中：j為批次，k為每批樣品測定次數。

低、中、高質量濃度質控樣品標準偏差均值公式為：

則相對標準測量不確定度為：

則丙戊酸低、中、高質量濃度質控樣品的相對標準測量不確定度分別為：ur( 1，L)=0.003 1，ur(1，M)=0.002 2，ur( 1，H)=0.000 2。

3.2 天平稱量（B類評定）

天平稱量引入的不確定度主要源于對照品稱量，采用精度為十萬分之一的電子天平稱取丙戊酸鈉對照品，以天平自動調零為一次扣皮。天平稱量引入的不確定度公式為：

式中：u（m）為重復性誤差，已在重復性試驗中考察，故此處不考慮u（m）；u（Δ，zeroing）為自動調零誤差；u（Δ，nonlinear）為天平非線性誤差；u（Δ，nonlinear）=a/k，a=a0，隨機變量半寬a=0.5e，天平分度e=0.01 mg，根據矩形分布，，則稱量對照品98.97 mg（按丙戊酸計）的相對標準測量不確定度為ur( 2 )=0.000 041。

3.3 對照品純度（B類評定）

3.4 溶液配制（B類評定）

溶液配制引入的不確定度主要源于量瓶及移液槍，配制過程中使用了5 mL 及10 mL 容量瓶（V）、2～20 μL（P1）、5～50 μL（P2）、10 ～100 μL（P3）、20～200 μL（P4）、100～1 000 μL（P5）移液槍，V、P2～P5的最大允差a分別為±2%、±0.6%、±2%、±1.5%、±1%，P1在10 μL 的相對最大允差為±1.2%，按三角形分布，。則容量瓶及移液槍的測量不確定度分別為：u（rV5mL）=0.001 633，ur（V10mL）=0.000 816，ur（P10μL）=0.000 245，u（rP2）=0.000 049，u（rP3）=0.000 082，u（rP4）=0.000 031，ur（P5）=0.000 004。

配制儲備液時使用了5 mL 容量瓶2 次、10 mL容量瓶2 次，配制工作液時使用了100 μL 移液槍1 次、200 μL 移液槍4 次、1 000 μL 移液槍23 次，計算溶液配制的相對標準不確定度：

3.5 含藥血漿樣品配制（B類評定）

配制含藥血漿樣品過程中使用20 μL 移液槍吸取10 μL 1次、50 μL移液槍1次、200 μL移液槍1次、1 mL 移液槍吸取500 μL 1 次，P5在500 μL 的相對最大允差為±1%，計算含藥血漿樣品配制的相對標準不確定度為：

3.6 提取回收率（B類評定）

取空白血漿95 μL，低、中、高濃度質控工作液5 μL，渦旋混勻15 s，加入乙腈800 μL 提取，渦旋震蕩5 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清測樣，得峰面積A1。另取空白血漿100 μL，加入乙腈800 μL，渦旋震蕩5 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清液700 μL，加入低、中、高濃度質控工作液4 μL 和內標工作液16 μL，渦旋混勻1 min，3 500 r/min 離心5 min，取上清測樣，得峰面積A2，每個濃度平行配制6 份（n=6），計算提取回收率=A1/A2×100%。結果見表2。

表2 人血漿中丙戊酸及內標提取回收率Table 2 The extract recovery rate of analytes and internal standards for valproate in plasma

計算丙戊酸提取回收率的相對標準不確定度：

計算內標提取回收率的相對標準不確定度：ur(7，L) =0.020 8，ur(7，M) =0.007 5，ur(7，H) =0.008 8。

3.7 基質效應（B類評定）

取空白血漿100 μL，加入乙腈800 μL 提取，渦旋5 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清液700 μL，加入低、中、高質控工作液4 μL 和內標工作液16 μL，渦旋混勻1 min，3 500 r/min 離心5 min，取上清；用純水代替血漿重復以上操作，每個濃度平行配制6份，測定，獲得分析物和內標的峰面積和基質效應，計算內標歸一化基質效應。

計算丙戊酸基質效應的相對標準不確定度：

3.8 標準曲線擬合（B類評定）

配制8 個濃度的標準曲線樣品（n=8），每個濃度平行測定3次（m=3），共測定24次（N=24）。擬合3 條標準曲線，測定濃度值記為x（gg=1，2，3，...，n），峰面積比記為yk(k= 1，2，3，...，N)，斜率記為am，截距記為bm。結果見表3。

表3 擬合標準曲線Table 3 Fitting standard curve parameters

自相關方差公式為：

式中：為平均測定濃度，丙戊酸標準曲線樣品濃度的均值為=31025 ng/mL，

殘余標準差公式為：S=，

則Sxx=29 748 409 787.23，S=22.281 3。

測定低、中、高濃度的質控樣品，每個濃度平行測定18 次（P=18），各QC 濃度的標準不確定度公式為：

式中：為斜率均值，為分析物與內標濃度比值的均值，低、中、高質控樣品的濃度均值分別為=1 312.96 ng/mL，=13 083.42 ng/mL，=75 679.78 ng/mL，則低、中、高濃度質控的相對標準不確定度為：ur(9，L) ==0.124 8，ur(9，M) =0.012 5，ur(9，H) =0.002 2。

3.9 儀器測定（B類評定）

使用Agilent 1260II-G6470A 液質聯用儀，高效液相色譜儀與三重四級桿的定量最大允差均為±1%，按均勻性分布，，則儀器測定的相對標準不確定度為：

3.10 合成及擴展不確定度

各分量相互獨立，根據不確定度傳播率法，合成相對標準不確定度公式為：

合成標準測量不確定度為：

則丙戊酸低、中、高質控樣品的合成相對標準測量不確定度分別為：Uc，r(L) =0.131 4，Uc，r(M)=0.022 5，Uc，r(H)=0.0184。合成標準測量不確定度分別為：Uc(L) =172.55，Uc(M) =294.86，Uc(H) =1 394.87。采用簡易評定法，P=95%置信概率（k=2），則低、中、高質控樣品的擴展不確定度分別為：UL=k×Uc(L) =345.09，UM=589.73，UH=2 789.74。

3.11 測定結果表示

人血漿中丙戊酸低、中、高質控樣品的測定結果可分別表示為（1 312.96±345.09）ng/mL，（13 083.42±589.73）ng/mL，（75 679.78±2 789.74）ng/mL。儀器測定、曲線擬合、基質效應和提取回收率是不確定度分量的主要來源，在低濃度時標準曲線擬合引入的不確定度值最大，在中、高濃度時基質效應和提取回收率引入的不確定度值最大，不確定度分量統計直方圖見圖1。

圖1 丙戊酸不確定度分量統計直方圖Figure 1 Statistical histogram of valproate uncertainty component

3.12 藥動學

將本檢測方法應用于24例中國健康受試者的藥動學研究（研究經過廣州市番禺區中心醫院醫學倫理委員會批準，批準號：2022-044-01），受試者分為空腹組和餐后組，每組12例，分別空腹或餐后單次口服丙戊酸鈉緩釋片500 mg。于給藥前0 h，給藥后0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72 h 采集靜脈血，并用本法測定其濃度。采用Phoenix WinNonlin（8.1版本）軟件計算主要藥動學參數，餐后給藥的Cmax為（25 634.42±4 861.452）ng/mL，AUC0-t為（834 372.7±188 164.1）ng/mL，AUC0－∞為（899 645.4±244 079.5）ng/mL，與文獻[12]相似，食物對丙戊酸的吸收具有滯后作用。24例受試者的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 24例中國健康受試者空腹或餐后口服丙戊酸鈉緩釋片500 mg后的平均血藥濃度-時間曲線圖Figure 2 The average plasma concentration-curve of valproate after oral administration of 500 mg of sustained release tablets on an empty stomach or after meals in 24 cases(±s,n=24)

4 討論

本文采用HPLC-MS/MS法測定人血漿中丙戊酸濃度，采用甲醇蛋白沉淀法，氘代內標校正，方法簡便且干擾少，提取回收率在98.01%～105.65%之間，RSD為5.82%，相比文獻[13-15]具有更高的提取回收率；內標歸一化基質效應在100.84%～104.26%之間，說明方法受基質效應影響小；批內、批間平均準確度偏差在-0.29%～6.39%之間，比文獻[14-15]的低。

由于樣品及溶液均為混合均勻的液體，且實驗過程中溫度嚴格控制于一定范圍內，故本研究未考慮溶液均勻性與溫度的不確定度考量。本研究結果發現，儀器測定、標準曲線擬合、基質效應和提取回收率是不確定度分量的主要來源，低質量濃度在標準曲線擬合與提取回收中引入的不確定度值較中、高質量濃度高，與文獻[16-18]結論一致。臨床治療中，丙戊酸鈉存在治療窗窄、個體差異大等問題，故一般設置較寬的線性范圍，提高LLQC 響應、增加總測定次數、設置合適的濃度點數和權重系數以及合理的線性范圍可改善標準曲線擬合對低質控樣品不確定度的影響。基質效應對低、中、高質控樣品不確定度影響均等，改進前處理方法、優化色譜分離條件等是降低基質效應、提高回收率的有效措施。含藥血清配制、對照品稱量與重復性測定引入的不確定度值較低，這可能是因為移液器使用次數少，天平精度較高。

本研究評定了HPLC-MS/MS法測定人血漿中丙戊酸濃度的不確定度，方法精密度高、準確度好，適用于人血漿中丙戊酸的藥動學應用及血藥濃度監測。設定合理的線性范圍和權重因子、優化提取方式和色譜條件等是提高測定結果準確性的有效方法。

（利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突）